武汉地区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒基因型分析

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1、武汉地区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒基因型分析【摘要】目的：了解武汉地区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV）基因型的分布情况。方法：取妇女宫颈的脱落细胞，利用基因芯片技术检测18种高危型HPV和5种低危型HPV。结果：总共检测606例，HPV总共感染391例，感染率64.5%。高危型HPV感染274例，感染率45.2%；高危型HPV感染率排在前5位的依次是HPV16（24.6%）、HPV18（10.4%）、HPV58（5.3%）、HPV33（2.8%）、HPV56（1.5%）。仅感染低危型HPV为117例，感染率为19.

2、3%。单一基因型感染332例，占感染人数的84.9%；两重感染53例，占感染人数的13.6%；三重感染6例，占感染人数的1.5%。结论：武汉地区妇女宫颈HPV感染率较高，主要为单一基因型感染；高危型HPV主要是HPV16和18，其次是HPV58、33、56。【关键词】宫颈；人乳头瘤病毒；基因型　　AnalysisofHumanPapillomavirusGenotypeDistributioninCervicalLesionofethods18highriskHPV(hrHPV)genotypesand5loenonghrHPVinfection,HP

3、V16ostmongenotype(24.6%),folloongHPVinfectioncases,332casesenostmongenotype,folloanpapillomavirus;Genotype　　宫颈癌是全世界妇女第二位最容易发生的癌症，每年新诊断出约470000例，每年死亡人数达250000［1］。HPV是宫颈癌发展的必要因素［2～5］。在感染人类的人乳头瘤病毒(HPV)中，已经测定基因序列的有100多种基因型［6］。在全世界，不同的地域，HPV流行的基因型有所差异，了解武汉地区妇女宫颈感染的HPV基因型分布情况，对监控HPV感染疫

4、情和将来使用HPV疫苗来预防宫颈癌的发生有很重要的指导意义。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1研究对象606例标本来自我院妇科门诊2005年1月至2006年12月诊断为宫颈上皮内瘤样变（cervicalintraepithelialneoplasiaCIN）Ⅰ级以上的患者，年龄16岁～60岁，平均年龄(31.5±8.2)岁。　　1.1.2试剂和仪器HPV分型基因芯片检测系统(亚能生物技术有限公司,深圳)；Biometra基因扩增仪(德国)，FYY3型分子杂交仪(江苏兴化分析仪器厂)。显色液须新鲜配制,按顺序加入以下溶液:C液(0.1mol/L

5、柠檬酸钠,pH5.4)19ml,四甲基联苯胺1ml,体积分数3%H2O210μl。20倍SSC,质量分数10%的十二烷基硫酸钠(SDS)、1mol/L柠檬酸钠均为深圳亚能生物技术有限公司提供,用时按所需浓度加蒸馏水配制。　　1.2方法　　1.2.1标本的采集及保存方法用专用毛刷,紧贴宫颈口黏膜,稍用力转动2周,以取得脱落细胞，将取样后的毛刷放入备有1ml无菌生理盐水的试管中,充分漂洗后将毛刷贴壁挤干丢弃。采集的样本没有及时检测时则放在-20℃保存。　　1.2.2样本处理方法将漂洗过毛刷的生理盐水全部转移到1.5ml离心管中,13000r/min离心10m

6、in,弃去上清,保留管底的细胞块。加入50μl裂解液充分混合,100℃加热10min。13000r/min离心10min,保留上清待用。　　1.2.3HPV基因芯片检测PCR扩增取PCR反应管一支,做好标记,于5000r/min离心2s,加入已提取的待测样品DNA5μl,反应总体系为25μl。每次实验设置一个阴性对照,即以5μl无菌纯水为模板。扩增条件:50℃,15min；95℃,10min；而后循环40次(94℃,30s；42℃,90s；72℃,30s)；72℃延伸5min。杂交及洗膜取固定有23种HPV分型探针的膜条放入塑料离心管,加入A液(2SSC

7、)及PCR产物,将塑料管放入沸水中加热10min后,放入杂交箱51℃杂交1h。于51℃轻摇洗涤15min。膜条转移至已于杂交箱中预热到51℃的40mlB液(0.5SSC)管中,轻摇洗涤15min,弃液体。显色膜条置于POD溶液室温轻摇浸泡30min,弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗2次,5min/次。用C液室温洗膜1min～2min,将膜条浸泡于显色液中避光10min左右即可见斑点显现,若显色液较弱可适当延长显色时间,显色完毕将膜条浸泡在水中清洗,最后取出膜条于4℃保存。结果判定作为阴性对照的杂交膜条会在PC位置出现蓝色斑点,同时其他位点不应该显色；检测

8、用的每张膜条在PC处均应有蓝色斑点出现,此时结果的判读视为有效。膜条上的探针排列