女性宫颈细胞中人乳头瘤病毒感染基因型探究

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1、女性宫颈细胞中人乳头瘤病毒感染基因型探究　　[摘要]目的探讨北京地区女性宫颈细胞中23种人乳头瘤病毒（HPV）感染的基因型分布情况，为宫颈癌的防治及疫苗的研发提供流行病学资料。方法采用HPV基因分型技术对北京地区2050例女性宫颈上皮细胞标本进行23种HPV基因型别检测，并对各种亚型的感染情况进行分析。结果2050例宫颈上皮细胞标本中检出HPV感染总体阳性率为25.85%（530/2050），其中高危型阳性率为17.37%（356/2050）；低危型阳性率为5.02%（103/2050）；在23种亚型中，最常见的类型依次为16、6、58、52、

2、43型，未检测出44、39及MM4型。HPV单一感染共检测出20种型别，其阳性检出率为19.12%（392/2050），最主要的为16亚型，占21.43%（84/392）。多重型别HPV感染阳性率为6.73（138/2050）；以二重感染最常见，占78.79%（109/138），其中（HPV11+43）、（HPV16+6）型各6例，是混合型感染的主要型别。结论本地区女性宫颈细胞HPV感染高危型以16、52、58型为主，低危型以6、43型为主。对宫颈HPV感染基因型的调查，可以有效降低HPV感染导致宫颈癌的概率，并为宫颈癌疫苗的研发提供流行病学资

3、料。[关键词]10人乳头瘤病毒；宫颈细胞；基因分型；基因芯片技术[中图分类号]R737.33[文献标识码]C[文章编号]1673-7210（2013）10（c）-0123-03宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌。人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）是引起女性宫颈癌最主要的因素，HPV感染使宫颈癌患病风险提高250倍。宫颈癌的发生和发展是一个先渐变后突变的过程。通常为宫颈上皮内瘤样变CINⅠ-CINⅡ-CINⅢ-原位癌-早期浸润癌-浸润癌。有研究认为由CINⅠ发展到CINⅢ平均需要9年时间

4、；而由CINⅢ发展到浸润性癌仅需3个月到2年。由于宫颈癌的癌前病变阶段较长，因此，HPV检测有利于宫颈癌的筛查和早期诊断，有效阻断病变过程，从而降低发病率和病死率，具有非常重要的临床价值。另外，目前已经有2种HPV预防性疫苗上市，分别为4价的Gardasil（抗HPV6、11、16和18型）和2价的Cervarix（抗HPV16、18型）。对于HPV基因分型的调查有利于从理论上评估该地区人群对这两种疫苗的效果，并为开发新的多价疫苗提供流行病学资料。本研究利用基因扩增和基因芯片技术，对女性宫颈细胞标本进行HPV基因分型检测，对宫颈病变的早发现、早

5、诊断、早治疗具有重要价值，并为HPV疫苗的研发提供流行病学资料。1对象与方法101.1研究对象收集2010年1月～2012年11月第二炮兵总医院体检中心体检的2050例女性宫颈上皮细胞标本作为研究对象；年龄15～91岁，平均（30.44±9.98）岁。所有对象均知情同意。1.2仪器与试剂HPV基因分型检测试剂盒购于深圳亚能生物技术有限公司；基因扩增仪为新加坡生产的GeneAmpPCRsystem2400型；分子杂交箱为韩国FINEPCR公司生产的combi-H12型，高速冷冻离心机为德国生产的Eppendorf5810R型。1.3方法1.3.1

6、标本的采集及保存采用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉拭子擦去宫颈口过多的分泌物，将宫颈刷置于宫颈口，顺时针旋转4～5周，慢慢抽出，以获得足够的宫颈上皮细胞标本，然后将宫颈刷头部放入洗脱管中，沿刷柄折痕处折断刷头，旋紧洗脱管盖，做好标志，保持采集管直立，放入-20℃冰箱保存待测。1.3.2HPVDNA的提取将宫颈刷头充分洗脱后，把洗脱液全部转移至1.5mL的离心管中，13000r/min离心10min，弃去上清液，保留管底的细胞沉淀。随后加入裂解液50μL，充分振荡混匀，在沸水浴中加热160℃10min，13000r/min离心10min后，保留

7、上清液待用。101.3.3PCR扩增取出PCR反应管（20μL），做好标记，低速离心数秒，分别加入已提取的DNA样品、空白对照、阳性对照各5μL，反应体系总体积25μL，最后加入一滴矿物油，低速离心数秒，上机扩增。扩增条件为50℃15min；95℃10min；94℃30s，42℃90s，72℃30s，共40个循环；72℃5min。1.3.4杂交、孵育和显色取15mL离心管，放入标有样本编号的膜条，加入5～6mLA液（2×SSC，0.1%SDS）及所有25mLPCR产物，拧紧管盖，再稍拧松，将离心管放入沸水浴中加热10min（确保A液液面完全位于

8、沸水浴液面之下），取出，拧紧管盖，放入51℃杂交箱内杂交1.5h。同时取50mL离心管，加入50mLB液（0.5×SSC，0.1%SDS）于水浴箱预热