康脑液对皮质区干细胞因子基因表达的影响

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　　康脑液对皮质区干细胞因子基因表达的影响【关键词】干细胞因子;大鼠;再灌注损伤;基因表达【ABSTRACT】Objective:Toobservetheexpressionofcortexareaendogenousstemcellsfactor(SCF)mRNAindifferentphasesaftercerebralischemiareperfusioninjuryinratsundertheinterventionofKangnaoyeprescription.Methods:ToestablishthemodelofcerebralischemiareperfusioninjuryonmiddlecerebralarteryinadultSDratsbythelinehitchlaintomodelgroup,medicineinterventiongroupandshamoperationgrouprandomly.DetecttheexpressionofcortexareaendogenousSCFmRNAiaiareperfusion，theexpressionofmedicineinterventiongroup,modelgroupSCFmRNAoperationgroupinthecorticalarea;atthe7thday,theexpressionofSCFmRNAreachedthepeakandbegantodecreaseatthe14thday.Conclusion:Theexpressionofcortexareaendogenousstemcells factor(SCF)mRNAafterthemedicineinterventionofcerebralischemiareperfusioninjuryhasthesameexpressionruleasthemodelgroupinthedifferentphases.ThereisnosignificantdifferenceinSCFmRNAexpressionofthetCellFactor,Rats,ReperfusionInjury,GeneExpression干细胞因子（SCF）作为一种多功能因子，是神经干细胞的存活刺激因子，在神经干细胞增殖中起主要的促进作用，本组实验目的是通过对大鼠脑缺血再灌注损伤后模型的建立，研究其在药物干预下在再灌注损伤不同时间SCF的mRNA表达规律。为中枢神经系统损伤后修复的研究与治疗提供理论依据。1材料与方法1.1实验动物和分组成年健康雄性SD大鼠36只，体重250～280g，清洁级，由北京大学医学部实验动物中心提供。应用线栓法经右侧颈总动脉插线建立右侧大脑中动脉阻塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)再灌注模型，随机分为模型组（n=16）：缺血1.5h再灌注1d、3d、7d、14d组，每时间组4只；药物干预组(n=16):建立相同的MCAO模型，胃饲康脑液2mL（配制）/每日晨，每时间组4只，按相同时间处理；假手术组（n=4）：假手术组除不插线外，其余步骤同模型组。 1.2药物成分自配康脑液主要由黄芪10g、丹参10g、川芎10g、葛根10g、钩藤10g、三七粉4.5g等组成，除三七粉外，每付药煎制前浸泡一夜，加水浸过药渣，文火煎开后半小时倒出药液，第二煎同前，将两煎的汤药混合，文火煎浓缩至70mL（根据公式算出，相当于每只鼠喂3.8g生药）。给药前将三七粉溶于药液中（每只鼠加0.1314g）。1.3标本的采集模型组和药物干预组动物在规定的时间里取材。分别于缺血1.5h再灌注1d、3d、7d、14d，取材，假手术组于手术后1d取材：大鼠在10%水合氯醛（300mg/kg）麻醉下，经左心室插管至升主动脉，依次灌入生理盐水200mL、4%的多聚甲醛300mL,灌注完毕后开颅，于前囟前2mm至前囟后3mm之间取脑，切块厚度5mm,置入4%多聚甲醛（含1/5000DEPC）中固定30～40min,蒸馏水浸泡4h。常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。于前囟前1mm至前囟后2mm之间连续冠状切片，厚度6μm。1.4标本固定先将组织用4%多聚甲醛初步固定3～5min以增加组织硬度，用刀片将标本切成厚度3mm左右的小块，再用4%多聚甲醛固定大鼠脑组织，固定时间30～40min。1.5统计学处理方法采用图像统计处理系统，各时间点阳性细胞计数以(ｘ±s)表示，组间比较用t检验。 1.6原位杂交检测原位杂交试剂盒、DAB显色试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供，严格按照试剂盒说明操作。1.7原位杂交信号显示DAB显色：光镜下观察出现棕黄色颗粒为阳性细胞，位于胞浆，核为蓝色。取部分切片不加探针以0.1mol/LPBS代替,做阴性对照。2结果脑缺血再灌注后SCFmRNA表达:①假手术组：皮质区SCFmRNA表达很弱（图1）。②模型组：缺血侧皮质区SCFmRNA表达第1d、3d、7d显著增高，7d达最高峰（图2），14d下降，但仍高于假手术组。③药物干预组:表达规律与模型组皮质区基本相同，第1d开始表达增强，第7d达高峰（图3），同样第14d下降，与模型组阳性细胞数比较没有显著性差异（表1）。2008年6月潘妍婷等：康脑液对皮质区干细胞因子基因表达的影响第3期2008年6月河北北方学院学报（医学版）第3期图1皮层假手术组SCFmRNA表达DAB显色(×200)图2皮层区缺血再灌注第7dSCFmRNA表达DAB显色(×200)图3药物组缺血再灌注第7dSCFmRNA表达DAB显色(×200)表1大鼠大脑皮质区SCFmRNA表达(x±s,阳性细胞计数/5个高倍视野)注：与假手术组比较* P<0.01，与模型组比较△P>0.053讨论3.1干细胞因子(StemCellFactor,SCF)在脑缺血再灌注损伤后内源性神经干细胞增殖中的作用SCF是一种多功能细胞生长因子,SCF与神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素等的共同作用下,可作为神经干细胞的存活因子刺激神经干细胞增殖，在细胞增殖、分化和迁移过程中发挥重要的调控作用[1]。脑缺血后内源性神经干细胞的活化与生长因子、信号分子、转录因子有着密切的关系[2]。外来信号通过与神经干细胞表面受体或核受体结合,将信息转导至细胞内,从而介导与增殖迁移分化有关的基因表达。黎逢光等在体外用简便高效方法由胚胎干细胞获得NSCs[3]，李力等在体外研究证实经类缺血处理后的皮质神经元可以促进培养的NSCs增殖[4]。本项试验中还推测缺血再灌注引起NSCs损伤、凋亡和坏死的同时还引起某种能够刺激神经增殖因子的分泌,促进了存活NSCs的增殖。本组试验结果显示，缺血再灌注后，SCF表达明显增强，与上述观点一致。研究表明,SCF在体外和体内都能刺激神经的形成，缺氧导致小鼠皮质培养神经细胞再生,SCF刺激培养细胞和整体动物皮质、侧脑室旁区和海马齿状回颗粒下层神经再生[5]，这种作用是通过分泌型SCF 而出现的，并通过特定的信号转导通路，使神经元前体细胞向神经元转化[6]。这为中枢神经系统损伤的细胞治疗提供了实验基础。本组实验结果显示，MCAO大鼠皮质区缺血再灌注第1d天SCF与阴性对照增加，第7d达高峰，14d下降，与上述实验缺血侧皮质神经干细胞增殖的表达规律基本一致：自1d开始有显著性增高，7d达高峰，28d回落，可以提示SCF在内源性神经干细胞的增殖中具有促进作用。3.2康脑液对缺血再灌后SCFmRNA的影响缺血性脑损伤存在两种细胞损伤机制,一是在缺血早期数小时内,神经元发生水肿、变性、坏死；二是在缺血再灌注后数天内,造成迟发性神经元损伤。众所周知：缺血再灌注后发生的病理变化是兴奋性氨基酸的释放、自由基的增多、以及钙的超载引起再灌注脑损伤后神经元发生水肿、变性、坏死。自配康脑液中的单方剂已明确其在缺血再灌注后脑损伤中的作用，主要通过扩张血管、抗血小板聚集，改善缺血脑组织血流量，抗自由基等作用起到神经保护作用。而在神经发生方面，本组实验提示康脑液对MCAO大鼠神经细胞SCF的mRNA表达无明显影响，提示康脑液在改善脑血液循环的同时，不影响SCF的mRNA表达规律，这种表达规律未受到药物影响，是否与SCF存在胞浆中有关。是否能间接提示SCF的持续存在继续促进NSC的增殖。 3.2.1兴奋性氨基酸兴奋性氨基酸的毒性作用可引起神经细胞的死亡。脑缺血后应用兴奋性氨基酸受体拮抗剂,一方面可使缺血的神经细胞免遭损伤,起到保护神经元的作用;但另一方面又抑制神经干细胞的增殖。兴奋性氨基酸对正常状态下与脑缺血时的神经干细胞的作用不同,一方面,这有利于加强神经元之间的联系,促进皮质功能的重建,另一方面,高兴奋性又可能使脑组织对局部理化环境的变动更为敏感,更易于损伤。而这种兴奋性氨基酸受体拮抗剂抑制脑缺血后的神经再生可能是因为其抑制了某些细胞因子的表达[2]，从而抑制了神经的生发。而康脑液单方剂，虽然有增加血流量，抑制兴奋性氨基酸的释放，起脑保护的作用，但通过本组实验显示康脑液对缺血再灌注损伤后的SCFmRNA表达规律无明显影响，能否间接提示康脑液不会抑制神经的生发，还有待于进一步的研究。3.2.2钙超载目前多数人认为缺血性脑损伤中的Ca2+超载被称为神经细胞死亡的最后共同通路。有试验表明：类缺血再灌注后NSCs内游离Ca2+浓度逐渐升高,至再灌注2h胞内Ca2+浓度达到最高峰,再灌注3h胞浆内Ca2+ 浓度开始降低[7]。氟桂利嗪作为一种Ca2+拮抗剂,可在一定程度上抑制胞内Ca2+浓度升高,但却无法完全阻断类缺血状态下胞浆内的Ca2+浓度升高,氟桂利嗪预处理已不具显著的保护作用[4]。因而推测缺血再灌注引起NSCs损伤、凋亡和坏死的同时还启动某种细胞自我保护机制,引起某种能够刺激神经增殖因子的分泌,促进了存活NSCs的增殖。本组实验结果显示与上述推论相符合：康脑液干预后缺血性脑损伤的SCF的mRNA表达不受影响，也可能与SCF存在于胞浆中有关，从而使SCF继续刺激神经干细胞的增殖。3.2.3自由基近年的研究发现，NO可通过抑制DNA合成和NSC的增殖，促使NSC向分化方向发展，在神经系统发育过程中起着重要的负性调控作用[1]，目前还未见报道自由基在缺血再灌损伤后神经干细胞的增殖中的作用。只有一项试验提示诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与脑缺血后的神经细胞再生有关[2]。而康脑液单方剂虽然有抗自由基的作用，但是通过清除自由基的作用是否影响干细胞因子的表达以及影响神经干细胞的增殖有待于进一步的研究。因此如何促进内源性神经干细胞增殖，是缺血后神经康复的重要问题，但依靠脑缺血后的自我神经修复可能对于缺损功能的恢复是很不够的,不过如果能够深入开展脑缺血后神经再生调控机制研究,然后对其再生影响因素进行有目的的调节,促进其自我恢复能力,可能是治疗脑缺血损伤的一个有效途径。而SCF作为重要的神经干细胞的存活刺激因子，需要进一步研究其在内源性神经干细胞增殖中的作用，将对中枢神经系统损伤后的康复具有积极意义。【参考文献】 1AbeK.Therapeuticpotentialofneurotrophicfactorsandneuralstemcellsagainstischemicbraininjury[J].JCerebBloodFloT,etal.Corticalneurogenesisinadultratsafterreversiblephotothromboticstroke[J].JCerebBloodFloicrogliaandneuralprogenitorstomechanicalbraininjury[J].Neuroreport,1999,10:228722926LieDC,ColamarinoSA,SongHJ,etal.aoXO,SunY,XieL,etal.Stemcellfactorstimulatesneurogenesisinvitroandinvivo[J].JClinInvest,2002,110(3):311319