全饥饿对脑皮质细胞凋亡与相关因子表达的影响

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摘要摘要目的研究全饥饿状态对大脑皮层细胞凋亡及其相关因子Bcl-2，Bax，Caspase-3的表达影响。方法成年雄性SD大鼠，健康清洁级90只，350±30g，随机分为6组（每组15只）：正常对照组（即正常进食组），饥饿组为五组即3d组、5d组、7d组、9d组、11d组。其后又将每一组随机分为三个亚组I、II、III组，每一个亚组5只。其中每一组I组应用苏木素-伊红染色法观测大脑皮质区神经细胞的形态变化，采用TUNEL法检测凋亡细胞，然后利用图像分析仪来计算凋亡细胞表达数和凋亡指数，以此推测全饥饿状态下大脑功能的变化。II组大鼠皮质区Bcl-2、Bax、Caspase-3三种因子表达的信使核糖核酸及蛋白，其表达情况利用逆转录PCR技术和免疫印迹试验来检测观察，以研究急性全饥饿对大鼠脑皮质区凋亡相关因子的影响。III组大鼠在不同饥饿时限时脑组织含水量变化利用干湿重比法来检测观察，以便我们了解在这种情况下脑组织是否存在脱水情况。结果1大鼠一般行为观察饥饿3d和饥饿5d组大鼠的一般状态良好，饥饿后期即饥饿7d、9d、11d组，大鼠的一般状况极度变差，精神状态较萎靡，对刺激反应迟钝。2大鼠重量的变化饥饿前，各组大鼠之间对其机体重量进行两两对比，均无统计学差异（P＞0.05）。随着饥饿时间的增加，大鼠的体重不断减轻。3皮质区HE染色形态学比较结果光镜下（×400）组织形态观察可见：正常对照组、饥饿3d组和饥饿5d组大鼠皮质区的细胞清晰饱满，形态完整，分布紧密规则，细胞质染色深，分布均匀，细胞核居中，有明显大量的神经纤维。随着饥饿时间的延长，饥饿7d、9d、11d组大鼠皮质区细胞排列极其稀疏紊乱，细胞线不清，细胞间隙增宽，间质水肿疏松，神经细胞丢失、细胞结构不清，尼氏体减少，细胞质染色淡，细胞坏死增多。4皮质区细胞凋亡的检测结果与正常对照组相比，皮质区凋亡细胞百分率，饥饿3d组无显著差异（P＞0.05）；饥饿5d组稍有增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；而饥饿后期7d、9d、11d组凋亡细胞百分比增加有显著差异（P＜0.01）。说明在饥饿早期，即饥饿3d时，大鼠皮质区神经细胞凋亡较少，饥饿5d组略有增加，而在饥饿后期，即饥饿7d、9d、11d时，大鼠皮质区凋亡细胞的数目明显增多。5逆转录PCR技术检测大脑皮质区在全饥饿状态下，三种凋亡相关因子其mRNA的表达结果与实验正常对照组相比，饥饿3d组Bax、Caspase-3mRNA表达无明显增高（P＞0.05），而饥饿5d、7d、9d、11d组Bax-I- 华北理工大学硕士学位论文mRNA、Caspase-3mRNA表达均显著增加(P＜0.01)；饥饿3d、5d、7d组Bcl-2mRNA的表达均增高（P＜0.05），5d组表达量最高（P＜0.01），9d、11d组表达降低（P＜0.05），11d组表达量最低（P＜0.01）。6免疫印迹试验检测大脑皮质区在全饥饿状态下，三种凋亡相关因子其蛋白的表达结果与对照组相比，饥饿3d组Bax蛋白、Caspase-3蛋白表达无增加（P＞0.05），饥饿5d组Caspase-3蛋白表达增加（P＜0.05），Bax蛋白表达明显增多（P＜0.01），饥饿后期组7d、9d、11d组Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达均显著增加（P＜0.01），差异有统计学意义；饥饿3d、5d、7d组Bcl-2蛋白的表达均明显增高（P＜0.01），5d组表达量最高，9d、11d组表达降低，11d组表达量最低（P＜0.01）。7干湿比重法各饥饿组的脑组织含水量与正常对照组相比，3d组增加不明显（P＞0.05），5d组明显增加（P＜0.01），饥饿后期（7d、9d、11d）组均下降（P＜0.01）。结论1全饥饿状态下大鼠皮质区神经细胞凋亡增加从饥饿第5d开始存在。2在全饥饿状态下，短期饥饿应激可能有一定的脑保护作用，而长期饥饿应激引起大量皮质细胞凋亡，导致脑功能受损，应积极的预防和治疗。3在全饥饿状态下，Bcl-2、Bax、Caspase-3因子在凋亡调控中起着非常重要的作用。图23幅；表6个；参65篇。关键词：全饥饿状态；大脑皮质；凋亡；Bcl-2；Bax；Caspase-3分类号：R338.2+5-II- 摘要AbstractObjectivesTostudythechangesofcorticalapoptosis-relatedfactorsasBcl-2,BaxandCaspase-3expressionafterstarvationinrats.MethodsNinetyadultmaleSDratsweredividedrandomlyinto6groups:blankcontrolgroup,3d,5d,7d,9dand11dstarvationgroups,15ratsineachgroup.AndeachgroupweresubdividedrandomlyintothreesubgroupsI,II,III,5ratsineachsubgroup.SubgroupIwasusedtodetecttheapoptosisofratcortexbyHEstainingmorphologicalcomparisonandTUNELmethod;subgroupIItodetectcortexBcl-2,Bax,Caspase-3mRNAandproteinexpressionbyRT-PCRandWesternblotmethod;subgroupIIItodetectthewatercontentofthebrainusingdrywetweightratiomethod.Results1Generalbehavior:Theratswerenotchangedin3dand5dstarvationgroups,buttheratesin7d,9dand11dstarvationgroupwereextremeweakandunresponsivetostimulation.2Thechangesofbodyweight:Therewerenosignificantdifferencesinbodyweightamongthegroupsbeforestarvation(P>0.05).Alongwiththestarvationtimeprolonged,thebodyweightofratsgraduallyreduced.3HEstainingofcortexneurons:Theneuronsofcortexregionwerearrangedinorder,withdeepcytoplasmicstainingandplentyofnervefibersinnormalcontrolgroup,3dand5dstarvationgroups,butwerearrangeddisordered,withwidenedintercellularspace,decreasednumberofcellsandlightcytopasmicstainingin7d,9dand11dstarvationgroups.4TUNEL-positiveneuronsincortexregion:NosignificantdifferenceinpercentageofTUNEL-positiveneuronsincortexregionwereobservedbetweennormalcontrolgroupand3dstarvationgroup(P>0.05).ThepercentageofTUNEL-positiveneuronsincortexregionwererelativelyincreasedinthe5dstarvationgroup(P<0.05)andweresignificantlyincreasedin7d,9dand11dstarvationgroupscomparedwithnormalcontrolgroup(P<0.01).Theresultsimpliedthattheneuronapoptosisincortexregionbecamemoreandmoreseriousalongwiththeperiodofstarvationprolonged.5RT-PCRmethodtodetecttheratcortexBcl-2,Bax,Caspase-3mRNAexpressionresults:BaxandCaspase-3expressionincerebralcortexweresignificantlyraisedinallfourstarvationgroups(P<0.01).Bcl-2expressionwasraisedin3d,5dand7dstarvationgroups,comparedwithcontrols(P<0.01),withtheheighestexpressionin5dgroup.Bcl-2expressiondecreasedin9d,11dstarvationgroups(P<0.01),withthelowestexpressionin11dstarvationgroup.6Westernblot-III- 华北理工大学硕士学位论文methodtodetecttheratcortexBcl-2,Bax,Caspase-3proteinexpressionresults:BaxandCaspase-3expressionincerebralcortexweresignificantlyraisedinallfourstarvationgroups(P<0.05in5d,P<0.01in7d,9d,11dgroups).Bcl-2expressionwasraisedin3d,5dand7dstarvationgroups,comparedwithcontrols(P<0.01),withtheheighestexpressionin5dgroup.Bcl-2expressiondecreasedin9d,11dstarvationgroups(P<0.01),withthelowestexpressionin11dstarvationgroup.7Theexperimentalresultsofdry/wetweightmethod:Comparedwiththenormalcontrols,therewasnoobviousincreaseinbraintissuewatercontentin3dstarvationgroup,butincreasedin5dstarvationgroup(P<0.01),anddecreasedin7d,9dand11dgroups(P<0.01).Conclusions1Theapoptosisofratcortexbegintoincreasefromthe5thdayofstarvation.2Short-termstarvationstressmayhavecertainbrainprotectionfunction,andlong-termstarvationstressmaycauseseverecorticalcellapoptosisandleadtobraindamage.3Bcl-2,BaxandCaspase-3playtheimportantroleinapoptosisregulationduringstarvationstress.Figure23;Table6;Reference65Keywords:starvation,cortical,apoptosis,bcl-2,bax,caspase-3Chinesebookscatalog:R338.2+5-IV- 目次目次引言........................................................................................................................1第1章实验研究........................................................................................................31.1材料与方法......................................................................................................31.1.1主要试剂................................................................................................31.1.2主要实验仪器........................................................................................31.1.3实验动物的选择....................................................................................41.1.4实验大鼠分组........................................................................................41.1.5全饥饿大鼠模型的复制........................................................................51.1.6标本的采集、处理及HE染色.............................................................51.1.7皮质区凋亡神经细胞的检测................................................................71.1.8RT-PCR法检测皮质区Bcl-2、Bax、Caspase-3三种因子mRNA的表达情况..............................................................................................................91.1.9Westernblot方法检测皮质区Bcl-2、Bax、Caspase-3三种因子蛋白的表达情况........................................................................................................111.1.10干湿比重法........................................................................................161.1.11统计学分析........................................................................................171.2结果................................................................................................................171.2.1大鼠一般行为观察及体重变化..........................................................171.2.2皮质区HE染色形态学比较结果.......................................................181.2.3各组大鼠皮质区神经细胞凋亡情况..................................................201.2.4大脑皮质区在全饥饿状态下Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA表达结果........................................................................................................................221.2.5大脑皮质区在全饥饿状态下Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达结果............................................................................................................................241.2.6大鼠脑组织含水量的变化..................................................................261.3讨论................................................................................................................261.3.1全饥饿大鼠动物模型的制备..............................................................271.3.2全饥饿状态对大鼠一般状况及体重的影响......................................27-V- 华北理工大学硕士学位论文1.3.3全饥饿状态对大鼠皮质区神经细胞凋亡的影响..............................281.3.4全饥饿状态下Bcl-2、Bax、Caspase-3三种因子在皮质凋亡中的调控作用................................................................................................................291.3.5全饥饿状态对大鼠脑组织重量的影响..............................................321.4小结................................................................................................................32参考文献...............................................................................................................32第2章综述..............................................................................................................372.1凋亡概述........................................................................................................372.2细胞凋亡信号传导途径................................................................................382.2.1死亡受体信号通路..............................................................................382.2.2线粒体途径..........................................................................................382.2.3内质网通路..........................................................................................392.3Bcl-2蛋白家族与细胞凋亡..........................................................................392.3.1Bcl-2蛋白家族的分类、结构与功能................................................392.3.2Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡中的调控机制........................................412.4Caspase蛋白与细胞凋亡..............................................................................422.4.1Caspase蛋白家族的分类、结构与功能............................................422.4.2Caspase-3在细胞凋亡中的作用机制..................................................432.5Bcl-2、Bax、Caspase-3三者在细胞凋亡中的相互作用关系.................432.5.1Bcl-2、Bax蛋白间的相互作用关系..................................................432.5.2Bcl-2、Bax蛋白表达能够作为Caspase-3的上游调控因素.........442.5.3Caspase-3亦能够作为bcl-2的上游调控因素..................................452.6小结................................................................................................................45参考文献...............................................................................................................45结论..........................................................................................................................52致谢..........................................................................................................................53导师简介......................................................................................................................54作者简介......................................................................................................................55学位论文数据集..........................................................................................................56-VI- 英文缩略表英文缩略表英文缩写英文全称中文全称PCDProgrammedcelldeath程序性细胞死亡TUNELTdT-mediateddUTPNick-EndLabeling原位末端转移酶标记技术SDS-Sodiumdodecylsulfat-polyacrylamidegelSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技PAGEelectrophoresis术AIFApoptosisInducingFactor凋亡诱导因子DDDeathdomain死亡结构域ANTAdeninenucleotidetranslocator腺苷转位因子VDACVoltagedependentanionchannel电子依赖性阴离子通道EREndoplasmicreticulum内质网UPRUnfoldedproteinresponse未折叠蛋白反应ERADERassociateddeathERS相关性细胞凋亡PTSDPost-traumaticstressdisorder创伤后应激障碍CytCCytochromeC细胞色素CApaf-1PolyADP-ribosepolymerase凋亡蛋白酶活化因子1CaspaseCysteinylaspartatespecificprotease半胱氨酰天冬氨酸激酶MPTPMitochondrialpermeabilitytransitionpore线粒体膜通透性转运孔MPTMitochondrialpermeabilitytransition线粒体通透性转变ERSEndoplasmicreticulumstress内质网应激PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳RNARibonucleicacid核糖核酸IP3RInositol1,4,5triphosphatereceptors1，4，5-三磷酸肌醇受体CLLChroniclymphocyticleukemia慢性淋巴细胞白血病DLBCLDiffuselargeBcelllymphoma弥漫性大B细胞淋巴瘤DNA-PCDNA-dependentproteinkinaseDNA依赖性蛋白激酶PARPPoly(ADP-ribose)polymerase多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶TRADDTNFreceptorassociateddeathdomainproteinTNF受体相关死亡结构域蛋白FADDFasassociateddeathdomainproteinFas相关死亡结构域蛋白CHOPCCAAT/enhance-bindingprotein-homologousproteinCCAAT增强子结合蛋白同源蛋白-VII- 引言引言世界卫生组织的相关报告显示，全球饥饿状态比过去更严重。死于饥饿相关的调查显示，每3.6秒钟全世界将有16000人死于饥饿，每天都有人死于饥饿或其并发症[1,2]。在人类中各种疾病（如神经性厌食症）[3]引起的患者昏迷或其他原因患者长期不能进食，严重消化道疾病导致营养吸收障碍，或者某些灾难（如矿井、建筑物坍塌、野外迷路等）、自然灾害（如地震、海啸、山体滑坡等）发生时，常造成遇难人员得不到食物，以及人为的长期过度节食[4]等均造成了不同程度的饥饿状态，而使机体处于一种急性饥饿危机。在较长时间饥饿状态下机体会启动应激反应，这种应激反应在保护机体的同时也会造成各个器官和系统的损伤，进而使消化、吸收、内分泌、泌尿等各种功能受到严重影响[5-8]，影响机体的生理功能。在饥饿情况下，动物的体内会产生很多的改变，如能量代谢[9]、激素[10]发生的改变，神经内分泌也会发生改变等，饥饿时随着血糖水平的下降，大脑等中枢神经系统的功能也明显下降。食物是维持生命活动必不可少的物质，脑是人体中对食物能量依赖性最大的器官之一，大脑与学习记忆功能、呼吸、运动以及摄食、生殖、情绪控制等行为有关，对饥饿十分敏感，相关研究证明饥饿对神经系统的影响非常明显[11-15]。因此饥饿状态可能因严重营养缺乏造成大脑组织结构和功能损害，从而影响患者脑功能的恢复。目前，国内对饥饿的研究多侧重于对胃肠道等消化系统以及能量代谢的影响[16,17]，然而对饥饿引起的相关激素、酶、基因表达[18,19,20]的相关研究则比较少见，而利用基因、蛋白技术，了解在饥饿情况下脑组织基因、蛋白表达的改变尚罕有报导。因此，本研究通过对大鼠进行不同天数的饥饿处理，探讨饥饿对脑组织神经细胞凋亡及相关凋亡因子表达的影响，从而反映人类在不同饥饿时限时导致的不同饥饿程度是否对脑功能造成影响，以为有效地预防和救治因严重饥饿而造成的伤害建立理论基础，这对临床上判断饥饿事故对人体相关脑功能的伤害程度，确定恢复期治疗方案及预后具有指导意义。在临床上我们治疗的主要方案是干预以及阻止其饥饿性损伤的发生发展，可以通过药物或人工干预患者后期的康复治疗等方法，这样对脑功能的保护和恢复，改善患者的生理自理能力，回到社会的怀抱中有重要的意义。这样我们应首要着力于研究寻找治疗的靶点、合适的治疗时间窗，以便针对靶点来找到适当的治疗方法，以减少饥饿应激性脑损伤所致的危害。迄今为止，关于细胞凋亡的探讨研究，更多的放在了有关肿瘤的发生发展及其-1- 华北理工大学硕士学位论文治疗的相关领域上。而关于肿瘤的治疗方法，关键步骤是介导肿瘤细胞发生凋亡，从而杀死肿瘤细胞的同时又不会造成正常组织的损坏。在研究饥饿应激造成的细胞凋亡上，我们与治疗肿瘤的方法恰恰相反，我们的目的是减少神经细胞凋亡，保护神经功能，所以我们要辩证地认识细胞凋亡。在因饥饿急性应激造成的细胞凋亡上，其调控因素还有很大的研究空间，值得我们进行深入的研究。郝旭丽[12]等人发现细胞凋亡参与了饥饿性损伤的病理生理过程，并且发挥了重要的作用。细胞凋亡是重要的机体自稳调节机制[21,22]，它是受基因和细胞内部、外部的一些因素调节的复杂的生物学过程。关于凋亡的报道研究将近有30年，然而至今，人们仍然能从其研究中得到新的意外发现，研究相关凋亡因子在细胞凋亡中确切的调控机制仍是现今科学研究和争论的一个热点话题。神经细胞主要包括神经元及其周围的胶质细胞，神经细胞凋亡后会对脑功能产生严重的影响。当神经元凋亡时致使神经元的数目减少，细胞间隙疏松，而神经胶质细胞凋亡又会使神经元凋亡，危害进一步加重，导致神经束功能障碍，促进脑功能损害。大脑皮层的受损会导致一系列问题甚至是非常严重的疾病。引起神经系统受损害的原因有很多，主要有情感剥夺、外界损伤和环境因素等，但任何原因引起脑功能异常都会导致中枢神经系统受影响，进而影响人的精神、情感、生理、学习和记忆能力[23,24]。凋亡相关因子的表达与饥饿后脑损伤神经细胞的凋亡是否有确切的联系，目前国内外研究相对较少。通过现有的研究可以明确的有脑组织海马区[11-13]：1饥饿损伤后会有不同程度的细胞凋亡发生；2Bcl-2，Bax是重要的凋亡相关蛋白，在饥饿性脑损伤后出现的凋亡过程中Bcl-2，Bax参与了调控，但在大脑皮质区它们是否表达以及如何调控尚有待商榷，要证明它们的联系只有通过实验进行科学的验证。因为机体细胞凋亡的过程十分复杂，凋亡诱因的不同、细胞周围微环境的变化、组织器官部位的差异，均可以导致细胞选择不同的凋亡通路，表达不同的凋亡蛋白。如果二者确有因果关系，那么控制Bcl-2，Bax的表达和生成就可以在一定程度上降低全饥饿损伤后神经细胞的凋亡。我们通过制备全饥饿模型，研究大鼠在全饥饿状态下脑组织神经细胞的凋亡以及相关因子Bcl-2，Bax，Caspase-3随时间而发生的动态变化并分析其相关性，以推测饥饿后Bcl-2，Bax的表达对神经细胞凋亡的影响，探讨饥饿时限对脑组织损害程度及机制的影响，并试图寻找到治疗的靶点和时间窗。-2- 第1章实验研究第1章实验研究1.1材料与方法1.1.1主要试剂细胞凋亡检测试剂盒贝博生物TrizolLifeTechnologiesRT-PCR试剂盒Invitrogen公司逆转录试剂盒Invitrogen公司引物的设计与合成Invitrogen公司5×上样缓北京普利莱基因技术有限公司Bcl-2抗体BioworldTechnologyCaspase-3（Active）一抗Affinity公司兔抗Bax一抗BioworldTechnologyGAPDH华安生物羊抗兔IgG武汉博士德ECL显色试剂盒Affinity公司BCA蛋白浓度测定试剂盒贝博生物DNase1（脱氧核糖核酸酶1）碧云天生物技术研究所ProteinaseK（蛋白酶K）石家庄市勃盛化学试剂有限公司DAB显示试剂盒（黄）石家庄市勃盛化学试剂有限公司1.1.2主要实验仪器转轮式石蜡切片机RM2245德国Leica公司恒温式附贴切片展片仪德国Leica公司全自动组织包埋机常州华利电子公司正立显微镜LeicaDMLB2图像采集分析器日本产JVCTK-C148lBEC电磁搅拌器Labnet公司漩涡仪Labnet公司迷你离心机海门市其林贝尔仪器脱色摇床上海海康电子仪器厂精密酸度计上海创发电子科技有限公司超净工作台天美科技有限公司数显三用恒温水箱江苏荣华仪器有限公司高压灭菌锅日本KOQYO公司移液器Gibico公司移液枪Gibico公司-3- 华北理工大学硕士学位论文WD800T型微波炉顺德格兰氏电器有限公司冰箱海尔公司-80℃超低温冰箱ULT1386-3Thermo公司定量PCRCFX96Bio-rad公司梯度PCRS1000Bio-rad公司低温高速离心机BeckmanQ3000型微量分光光度计美国QuawellTechnology，Inc公司iMarK酶标仪Bio-rad公司蛋白电泳和转膜及核酸电泳设备Bio-rad公司凝胶成像系统Bio-rad公司1.1.3实验动物的选择实验所用的动物由华北理工大学动物实验中心提供，实验动物机构许可证号：SCXK（冀）2009-0003。动物的纳入标准为：成年雄性12周龄健康清洁级SD大鼠，体重350±30g，总共90只。保持25±2℃的室温，50±10%的相对湿度，人工照明时间12小时，使用排空扇自动抽气，每天早上更换食物、垫料和饮用水1次，喂养并观察4天后，将能正常进食和饮水者纳入实验用鼠自由饮食，分笼适应性喂养两周后进行实验。随机分为两大组，正常组和饥饿组，然后再将每组根据饥饿的时间点分为3d组，5d组，7d组，9d组，11d组五组，每组到相应时间点处死动物。在动物饲养过程中的损失，依照实验原有的数来补足。1.1.4实验大鼠分组将符合纳入标准的90只实验动物随机分成6组（n=15），即：正常对照组（正常饮食），饥饿组分成五组：3d组，5d组，7d组，9d组，11组。其后又将每一组随机分为三个亚组I、II、III，每一个亚组有5只，其中每组I组应用苏木素-伊红（HE）法检测大脑皮质区神经细胞的形态变化，皮质区凋亡细胞的表达情况采用TUNEL法来检测观察，然后利用图像分析仪来计算凋亡细胞表达数和凋亡指数，以此推测全饥饿状态下大脑功能的变化。II组大鼠皮质区的Bcl-2、Bax、Caspase-3三种因子表达的信使核糖核酸（mRNA）及蛋白，其表达情况利用逆转录PCR技术（RT-PCR）、免疫印迹试验（Westernblot）来检测观察，以研究急性全饥饿对大鼠脑皮质区凋亡相关因子的影响。III组大鼠在不同饥饿时限时脑组织含水量变化利用干湿重比法来检测观察，以便我们了解在这种情况下脑组织是否存在脱水情况。-4- 第1章实验研究1.1.5全饥饿大鼠模型的复制正常对照组给予正常饮食，饥饿3d、5d、7d、9d、11d组在相应的饥饿天数内禁食不禁水，于每日早上9:00测定体重，观察大鼠在喂养期间体重变化情况，并比较各组间体重差异是否显著。各组I组大鼠在达到相应饥饿天数后，立即以10%水合氯醛以0.30ml/100g体重腹腔内注射麻醉动物，这种剂量的麻醉药可以使大鼠处于深度麻醉。达到深度麻醉后消毒、铺巾，开胸，分别用0.75%生理盐水和4%多聚甲醛溶液经圆钝针头灌注左心室、主动脉，随后断头取脑组织。用特制的咬骨钳从枕骨大孔处钳开，仔细分离出整个大脑结构，在乳头体和视交叉相交联处将脑结构体垂直横断后，取大脑顶叶皮质（相当于Krieg2、3区）的冠状切面（厚约4mm），置于4℃0.1M的4%多聚甲醛溶液浸泡后固定以备制作石蜡标本，用于HE和Tunel检测。各组II组大鼠达到相应饥饿时限后，在深度麻醉下，断头处死后快速分离取来脑组织，用预冷的PBS冲洗其血迹，之后放到冰盘上，快速分离其双侧顶叶皮质，放到超低温冰箱（温度为-80℃）中保存，用于逆转录PCR技术和免疫印迹试验。各组III组大鼠在深麻下断头取脑，除去嗅脑、小脑、脑干和松果体，分离出大脑半球。1.1.6标本的采集、处理及HE染色1）标本的采集固定：正常对照组，饥饿3d、5d、7d、9d、11d组的I组大鼠在达到相应饥饿天数后，立即麻醉动物，麻醉药使用10%水合氯醛，以0.30ml/100g（体重）剂量对其进行腹腔内注射，在达到深度麻醉后，消毒铺巾、剖开胸腔，使整个心脏暴露出来，包括视野下能见到主动脉和右心耳，之后圆钝针头穿过左心室置入主动脉，跟输液管路连接后，用温度为37℃、含有少量肝素的0.75%生理盐水进行快速灌注，同时，剪一个小切口在右心耳上，使灌注液流出，当流出的液体晶莹透亮，肝脏和肠系膜的颜色色泽发白，随后再灌输4℃预冷的4%多聚甲醛约三四百毫升。在开始输液时速度要稍微快些，直到大鼠四肢抽搐，此时输液速度要减慢，直至达到大鼠的四肢、躯干及尾巴是完全僵化的状态，缓慢输注时间约为1~1.5h（如图1）。灌注完后断头取脑，用组织剪剪开颅脑顶部的毛发、皮肤及其软组织使颅骨暴露出来，沿着枕骨大孔用咬骨钳将枕骨咬开，把顶骨和颅骨都去除，然后紧挨脑-5- 华北理工大学硕士学位论文底部用眼科剪把硬脑膜剪开，轻轻拨起整个脑组织暴露并剪断视神经，此时即可取出带有嗅球的脑组织。将脑组织放于蜡板上，取大脑顶叶皮质（相当于Krieg2、3区）的冠状切面（厚约4mm）。图1灌注动物Fig.1Reperfusionanimal后固定：把已经被切好的冠状组织切片放到4%聚甲醛溶液（0.1M，4℃）中，在此溶液中浸泡24h。2）载玻片的处理在载玻片使用之前，要将其放进重铬酸钾硫酸液中，浸泡一夜，之后将其拿出用水冲洗干净，蒸馏水清洗三次，在洁净的地方晾干，然后将多聚赖氨酸（1:6比例配制）涂在盖玻片和载玻片上，放入60℃烤箱烤约1h，储存在干燥的地方留以备用。3）石蜡包埋切片取出固定液中的组织标本，放到冲水槽中用自来水冲洗最少达6h，50%乙醇（4h），70%乙醇（6h），80%乙醇（过夜），90%乙醇（4h），100%乙醇I（1h），100%乙醇II（45min），二甲苯I（10min），二甲苯II（15min），将组织标本放到恒温浸蜡箱（65℃）中浸蜡，石蜡I（40min），石蜡II（50min），石蜡包埋。严格垂直定向石蜡包埋，切片，每个时间点、每只大鼠标本均连续切片20张，切片厚度为5µm，HE染色，相邻切片留做TUNEL试验。留作病理实验标本切片分成两组，一组用于HE染色，另一组用于TUNEL凋亡神经细胞的检测。4）HE染色（1）将组织切片放到恒温烤箱中烤30min至1h，取出后放到二甲苯中，二甲苯I、II中各10min。（2）100%酒精I、II中各5min以洗去二甲苯。-6- 第1章实验研究（3）组织切片逐步放到95%酒精I、II中各5min，85%酒精中3min，75%酒精中2min，60%酒精中2min。（4）自来水洗涤（水化）2~3次。（5）苏木素染液5~8min，自来水冲洗2~3min。（6）1%盐酸酒精中分化数秒钟（5~10s），自来水清洗2~3次。（7）组织切片放到自来水中冲洗，返蓝15min~30min。（8）0.5~1%伊红染液中1~2min。（9）将切片逐步放到酒精中脱水，分别是75%酒精中1min，85%酒精中1min，95%酒精I、II中各3min，100%酒精I、II中各5min。（10）二甲苯I、II中透明各10min。（11）染好的切片用中性树胶进行封片，待其干燥，在显微镜下观察，并记录各组切片的形态变化。1.1.7皮质区凋亡神经细胞的检测1）动物及分组：同前。2）取材：同前。3）对各组大鼠皮质区凋亡神经细胞的检测：采用TUNEL法来检测凋亡细胞的表达，此种方法是现今国内外学者广泛使用的一种先进方法，其检测结果普遍被认为有其说服性。本实验应用贝博生物公司的TUNEL试剂盒，并且按其说明书严格操作，其主要的操作步骤如下列出：（1）将组织切片用二甲苯洗3次，5min/次。（2）组织切片于100%乙醇I、II中，各5min。（3）之后分别放入四个不同浓度的酒精中，即95%酒精、85%酒精、75%酒精、60%酒精，各3min。（4）PBS清洗5min。（5）加入新鲜稀释的蛋白消化酶（胰酶0.125%）或蛋白水解酶K（20ug/ml），室温放置15min，在染色缸中或直接加到载玻片的组织上（60ul/5cm2），每个组织加15ul。（6）去离子水洗2次，2min/次。（7）将组织切片放到常温的含3%H2O2的PBS中，浸泡5min，用以消除组织中的内源性过氧化物酶。（8）PBS洗2次，5min/次。-7- 华北理工大学硕士学位论文（9）将切片上多余的液体轻轻甩去，之后仔细擦拭干净组织周围剩余的液体。（10）立即在组织上直接加平衡液，按其75ul/5cm2的量加入，即每个组织加15ul，然后置入4℃环境下1h。（11）将切片上多余的液体轻轻甩去，之后仔细擦拭干净组织周围剩余的液体。（12）在切片上滴加TdT酶反应液，每个组织加11ul（55ul/5cm2），放到湿盒中孵育1h，将湿盒置于37℃恒温箱中。（13）放组织切片在加有Workingstrengthstop/washbuffer的染色缸，搅动15s，然后室温下孵育10min。（14）取出一份anti-digoxigneninconjugate从原料瓶中足够预计的组织切片用，使这一份温度增加到室温。（15）PBS洗3次，1min/次。（16）将切片上多余的液体轻轻甩去，之后仔细擦拭干净组织周围剩余的液体。（17）滴加室温anti-digoxigneninconjugate结合到组织切片上，65ul/5cm2，湿盒中室温孵育30min。（18）PBS洗4次，2min/次。（19）将切片上多余的液体轻轻甩去，之后仔细擦拭干净组织周围剩余的液体。（20）滴加足够的DAB以完全覆盖组织（75ul/5cm2），室温染色3~6min。为了确定最佳染色时间，在显微镜下观察组织颜色变化。（21）去离子水洗3次，1min/次。（22）去离子水常温孵化5min。（23）苏木素复染3~5s。（24）1%盐酸酒精分化1s。（25）自来水返蓝20~30min。（26）之后组织切片被依次放入四种不同浓度的酒精中，70%酒精、80%酒精中各3min，95%酒精I、II中各5min，100%酒精I、II中各5min。（27）二甲苯I、II各10min。（28）中性树胶封片。（29）待组织切片干燥后在显微镜下进行观察，分析其染色结果，阳性表达细-8- 第1章实验研究胞（凋亡细胞）结果判读：核中呈现棕色或棕黄色、棕褐色颗粒的细胞。在光镜×400视野下观察脑皮质区10个视野，计数各视野凋亡神经细胞数目，计算平均值。4）图像及数据处理采用日本产奥林巴斯CX41-JVCTK-C1481BEC高分辨彩色病理图像报告分析系统进行图像分析处理。取各大鼠脑组织的连续组织切片，各组每个时间点每只大鼠选取一张切片。在40倍镜下对图像进行采集，观察并分析其细胞的凋亡。每张TUNEL染色切片取不同的10个视野区域，应用图像分析软件测定各组细胞的凋亡率。c=（a/b）×100%（c：细胞凋亡率；a：10个视野凋亡细胞数；b：10个视野总细胞数），并且若凋亡指数呈现增高的趋势则表明细胞的凋亡程度就越高。1.1.8RT-PCR法检测皮质区Bcl-2、Bax、Caspase-3三种因子mRNA的表达情况本实验应用逆转录PCR技术（RT-PCR）来检测大鼠皮质区神经细胞的相关凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase-3，此三种因子在不同饥饿的时限下其mRNA的表达情况。1）组织总RNA提取分别取各组不同饥饿时间点的大脑皮质，提取总RNA。具体的实验操作步骤按照Trizol试剂盒说明书的指导来执行，如下：（1）称取100mg的大鼠皮质组织放到EP（1.5ml）管中，之后加入Trizol溶液1ml，使用锥形头状搅拌棒将其捣碎后放在室温下5min，使组织充分被裂解。（2）加入200ul/1mlTrizol，立即盖上盖子，轻柔上下颠倒15秒钟，在室温环境下静置5min，于12000r下低温离心15min，待离心结束转子不动后，小心缓慢的取出上层无色透明的水溶性层，此层中含有RNA，操作过程中我们要注意的是小心操作，切记粗暴，使膜层处于完整不被破坏。（3）小心吸出上层溶液500ul移到一个新的离心管中，然后加入500ul异丙醇/1mlTrizol，在室温静置10min，于12000r下低温（4℃）离心后，丢掉其上面无色透明的清亮层，此时我们在EP管的底部可以见到白色的似胶冻样的沉淀，此即为RNA。（4）在EP管中至少添加1ml75%酒精/1mlTrizol，在溶液中对其沉淀进行吹打，此操作手法宜轻柔，使沉淀在酒精中散开，于7500r下低温离心5min，之后将tube管口倾斜45度，缓慢吸出其上面无色透明的清亮层，将其丢掉。（5）将EP管处于半开盖状态，待几分钟后观察其沉淀从全湿状态转为半干-9- 华北理工大学硕士学位论文状态时，向管内加入无RNA酶水20ul，在溶液中对其沉淀进行吹打，此操作手法宜轻柔，使沉淀在溶液中溶解。（6）将4ul总RNA加至200ul灭菌水中，测量RNA浓度。RNA浓度测定：用型号Q3000微量分光光度计测定提取的总RNA浓度，在测定过程中，仪器探针要用无RNA酶水清洗3次，调制空白档，且首先测定溶剂（无RNA酶水）的浓度，再依次测定各样品RNA的浓度（测定时选取1ul样品进行测定，且每样品测定之间均要求清洗探针）。在基因检测过程中，合格的RNA样品，其纯度值260/280nm约在1.8～2.1之间，并且其260/230nm的值约在2.0～2.2之间。同一样品其260/230nm的值要高于260/280nm的值，否则表明RNA样品中含有DNA污染，会影响后续逆转录反应，根据所测RNA浓度，计算出各组别所需RNA的体积。（7）用灭菌水将RNA稀释到1ug/ul备用。2）cDNA第一链合成（逆转录，RT）在20ul反应体积中进行，成分如下：（1）特定无核酸酶微量离心管中加以下剂量物质：组份量引物1ul模板总RNA1ng~5ug10mMdNTP混合物1ul灭菌蒸馏水To12ul（2）在机器上设置65℃的加热条件，给加入上述物质后所成的混合物加热5min，之后快速放到冰上进行冷却，离心1min后，添加以下成分：组份量5×第一链合成缓冲液4ul0.1MDTT2ulRNaseOUTTM1ul（3）将加有上述多种成分的物质在微量离心管中混匀，并进行短暂离心后，在37℃的恒温环境下对其进行孵育，时间为2min。（4）之后将1ulM-MLV逆转录酶添加到上述微量离心管中，在室温环境中放置，对其进行吹打混合均匀，此操作手法宜轻柔，切忌粗暴。（5）在设置为37℃的环境步骤下将上述混匀物质进行孵育，时间为50min。（6）之后将上述物质在70℃环境下进行加热，时间为15min，此步骤的目的是使其反应最后终止。3）PCR扩增-10- 第1章实验研究由Invitrogen公司来合成PCR相应的特定引物：引物名称序列Caspase-3ForwardprimeTTACCCTGAAATGGGCTTGTReverseprimerTGCTCCTTTTGCTGTGATCTBcl-2ForwardprimeCTGGCATCTTCTCCTTCCAGReverseprimerCGGTAGCGACGAGAGAAGTCBaxForwardprimeCAGGATCGAGCAGAGAGGATReverseprimerAAACATGTCAGCTGCCACACGAPDHForwardprimeGACTCTACCCACGGCAAReverseprimerGGATGACCTTGCCCACA此实验中PCR扩增体系使用20μl体系，把下列物质加到无核酸酶的微量离心管中：Mix17μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cDNA1μl，共20μl。然后按下述条件进行PCR反应：94℃4min、94℃30s、58℃30s、72℃1min，40次反复循环扩增，最后72℃延伸5min。同时，用GAPDH（磷酸甘油醛脱氢酶）作为进行PCR的内部参照物。4）扩增产物鉴定在150ml的锥形瓶中加入琼脂糖1.0g（2块胶的量），50ml的TBE，最后加5μlRed，混匀后，放到微波炉中加热1min，之后在室温下放置1h左右，使琼脂糖凝胶变凉凝固。之后在电泳槽中加入电泳缓冲液，将PCR扩增产物及Marker加到琼脂糖凝胶中，电泳电压设置为80V，样品跑到整个凝胶的2/3即可停止扫描显影。Bcl-2、Bax、caspase-3和GAPDH四种条带，使用凝胶扫描成像分析仪处理系统对其进行光学密度扫描，计算每条电泳条带的平均光密度和面积，PCR扩增产物的含量用所得的平均光密度乘以其面积来表示，GAPDH来作内参，便可计算出三种因子的表达量和GAPDH表达量，每种因子表达量与后者的比值即为其相对表达量。1.1.9Westernblot方法检测皮质区Bcl-2、Bax、Caspase-3三种因子蛋白的表达情况1）实验常用液体配制（1）制备浓度为30%的丙烯酰胺（比例为29:1）丙烯酰胺29.0gN，N+-亚甲双丙烯酰胺1.0g上述物质分别用温热的去离子纯水溶解，之后再用纯水稀释到最终容量100ml。用滤纸过滤后在棕色试剂瓶中存放，避光4℃保存，有效期为一个月。（2）分离胶缓冲液（PH8.8）-11- 华北理工大学硕士学位论文Tris45.43g超纯水200ml将Tris称量出45.43g，之后用200ml去离子纯水将其溶解。在上述溶液中加入浓盐酸，将其PH调至8.8，最后用去离子水最后定容到250ml，将此溶液存放在室温下。（3）浓缩胶缓冲液（PH6.8）Tris15.14g超纯水200ml将Tris称量出15.14g，之后用200ml去离子纯水将其溶解。在上述溶液中加入浓盐酸，将其PH调至6.8，最后用去离子水最后定容到250ml，将此溶液存放在室温下。（4）10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g超纯水1.0ml过硫酸铵称量0.1g，然后用1.0ml去离子水溶解，搅拌均匀后放置4℃后，有效期为一周。（5）十二烷基硫酸钠10％SDSSDS10g称量SDS10g，用100ml去离子纯水在50℃的温度下溶解后，溶液在室温下保存。（6）1.74mg/ml（10mmol/L）PMSFPMSF0.174g将PMSF称量出0.174g，用100ml异丙醇将其溶解混匀后，分别装进离心管（1.5ml）中，将此溶液存放在-20℃的环境下。（7）还原型5×SDS上样缓冲液0.5mol/LTris·HCl（PH6.8）2.5ml二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39gSDS0.5g溴酚蓝0.025g甘油2.5ml将上述物质混匀后，分别装入离心管中，在4℃环境下保存。（8）电泳液缓冲液Tris3.03g甘氨酸18.77gSDS1g蒸馏水至1000ml将上述物质称量好，用去离子纯水将上述物质溶解混匀并稀释到最终容量-12- 第1章实验研究1000ml，将此溶液存放在室温下，此溶液可重复使用，但次数有限，为3～5次。（9）转移缓冲液Tris5.8g甘氨酸2.9gSDS0.37g甲醇200ml蒸馏水至1000ml将上述物质称量好，之后用去离子纯水将上述物质溶解混匀并稀释到最终容量1000ml，将此溶液存放在室温下，此溶液亦可重复使用，但次数有限，为3～5次。（10）TBS缓冲液1mol/LTris·HCl（PH7.5）10mlNaCl8.8g蒸馏水至1000ml（11）TBST缓冲液20％Tween201.65mlTBS700ml混匀后即可使用，最好现用现配。（12）显影液（5×）温度为50℃的自来水375ml（以下药品加到温水中）米吐尔1.55g亚硫酸钠（无水）22.5g碳酸钠（无水）33.75g溴化钾20.95g补水至500ml将称量好的上述药品逐个加到50℃的自来水中，待其一完全溶解后再加入另外一种，之后加水定容到500ml，在4℃环境下保存，使用时用自来水稀释至1倍。（13）定影液温度为50～60℃的自来水700ml亚硫酸钠（无水）15g冰乙酸12.6ml硼酸7.5g钾明矾15g将上述物质称量好，加入到700ml温度为50～60℃的自来水中溶解，待水温降为30℃时加入硼酸7.5g，溶解混匀后，再加水使之定容到1000ml，将此溶液放在室温下保存。-13- 华北理工大学硕士学位论文2）提取动物组织蛋白提取不同饥饿时限下的大鼠脑皮层组织的蛋白，严格按照以下步骤操作进行：（1）称量出脑皮质组织100mg，用预冷的PBS清洗2次，之后放到冰袋上用眼科剪将其剪碎，再用PBS清洗2次，将其放到圆底EP管中，用小型离心机离心将组织上的PBS弃掉。（2）按照1：5的脑重量比加入蛋白裂解液（RIPA）。（3）超声匀浆，将组织与裂解液混合，将超声匀浆机探头插入到圆底EP管中，调控机器，探头振幅Ampl40%，cycleon10s，cycleoff5s。匀浆器匀浆5～10次，待到大约95%的细胞都被破碎掉停止，之后冰上裂解1h。（4）离心机提前预冷半个小时，设置转速为12000转、温度为4℃、离心25min，离心完成后取出其上清液即为组织总蛋白，将其放到新的离心管中。（5）分装好后-80℃保存，不要反复冻融制备样品。3）组织蛋白定量采用BCA法根据BCA蛋白定量试剂盒的说明书，严格按照以下步骤操作进行：（1）制作标准蛋白浓度溶液：Albumin（2mg/ml），100μl原液+900μlddH2OVorter几次后浓度即为200μg/ml，500μl上述浓度的溶液+500μlddH2OVorter几次后浓度即为100μg/ml，500μl上述浓度的溶液+500μlddH2OVorter几次后浓度即为50μg/ml，500μl上述浓度的溶液+500μlddH2OVorter几次后浓度即为25μg/ml。（2）对提取的蛋白样品进行10倍的稀释：5μlSample+45μlddH2O。（3）BCA工作液的量=（样品数+标准品数）×200μl，A液：B液=50：1，充分混匀。（4）先取25μl上述标准蛋白及稀释后的蛋白样品于96孔板内，后加入200μlBCA工作液，混合30s后，在37℃的恒温环境下反应30min，取出后待温度降至室温。（5）将降至室温的96孔板放入伯乐imark机器的孔槽中，设置软件界面后震荡10s，查看测量数据并记录下蛋白浓度。4）电泳上样样品的准备（1）从-80℃冰箱中取出蛋白，立即放在冰上为了减少蛋白的降解，直至完全融解。（2）在EP管中加入15ul蛋白样品，再加5ul4×蛋白凝胶电泳上样缓在每一个样品管并轻轻搅拌均匀后，放沸水中煮5min，待其温度降至室温后，使用微型离心机离心收集管壁残留样品，待用。-14- 第1章实验研究5）蛋白电泳采用SDS-PAGE技术来进行蛋白电泳，具体操作步骤如下：（1）准备制胶的玻璃槽：在两块特制玻璃板中间放两条垫片，用透明胶带或5%的琼脂糖将两侧及底面全封实，之后在玻璃板上画条防水蓝线（在大约距离样品梳底部1.0cm的位置），用来确定灌制分离胶的液面。（2）12%的SDS-PAGE分离凝胶的制备（6ml）:去离子水1.98ml30%Acr-Bis2.4ml1.5mol/LTris-HClpH8.81.5ml10%APS60ul10%SDS60ul在10ml管内加入上述物质，最后加3ulTEMED，混匀。（3）将制好的分离胶混合均匀后，用移液枪轻轻加到玻璃槽中，灌到蓝线处时即停止，操作过程防止气泡产生。（4）灌完胶后立即加去离子纯水，直至溢出玻璃槽（从空气中隔断，有助于凝胶表面上形成一直平面），放置于室温下分离胶凝固约40分钟。（5）配制5%浓缩胶（2ml）：去离子水1.05ml30%Acr-Bis0.33ml0.5mol/LTris-HClpH6.80.5ml10%APS20ul10%SDS20ul在10ml管内加入上述物质，最后加入TEMED2ul（临灌胶前再加），混匀。（6）将凝固好的胶上覆盖液弃掉，再冲洗胶表面3～4次，并用吸水纸轻轻吸掉残留的液体。（7）把凝胶板重新放好，将混合均匀的浓缩胶轻轻加入板中，动作亦轻柔防止气泡生成，之后将样品梳插上，室温放置待浓缩胶凝固，约40分钟。（8）将梳子拔除，动作亦轻柔，把带有胶的玻璃板固定在电泳槽上，槽中加好1×电泳缓冲液。（9）按序加样品，用无菌枪头的移液枪将25ug变性蛋白吸出，垂直贴紧加样孔的上方，在凝胶孔中轻轻加入蛋白样品，用GAPDH作为内参照物。（10）电泳装置接通电源，电压调制为稳压状态，样品途经整个浓缩胶时的电压为80V（约8v/cm）。当染料泳分离胶时，可调节成高电压，设置为120V约（12v/cm），维持此电压状态使染料继续电泳，当染料泳到分离胶的底部时，结束-15- 华北理工大学硕士学位论文电泳。（11）裁剪出PVDF滤膜和6层滤纸，裁成与胶相同的尺寸。滤膜转膜前在甲醇中泡5min，之后和滤纸一同在转膜液中震荡浸泡15min，待用。（12）电泳结束后关闭电源，将胶与膜放进转膜夹板中，从负极侧开始，先放一层海绵片、三层滤纸（注意操作过程中去除气泡），放上样品胶（操作过程中亦轻柔，防止过度拉伸影响结果），之后对应所需蛋白的相应分子量放上PVDF滤膜，再放三层滤纸（注意操作过程中去除气泡）、一层海绵垫片，将转膜夹板扣紧安装好，放到转膜槽中，槽中加满转膜液。电泳迁移线连接正确，确保从负到正的电荷流动，接通电源，恒流条件下，100mA转膜1h（此步操作宜在4℃冰箱或冰水浴中进行）。（13）转膜完成后，小心取出转移膜，放到5%脱脂牛奶（10g脱脂牛奶，200mlTBST）中，室温、摇床上缓慢摇动状态下封闭2h。验证蛋白是不是彻底转到了膜上，将凝胶使用考马斯亮蓝染色液处理，看凝胶上是否显示蓝色。（14）将一抗用封闭液稀释1：200倍，之后将PVDF膜放到塑料袋中，分别在对应的分子量条带中加入相应的一抗（兔抗鼠Bax单抗、Bcl-2单抗、Caspase-3单抗、GAPDH单抗），将袋中的气泡挤出，之后用封膜机器将口封闭好，放到摇床上缓慢摇动，4℃冰箱中反应过夜。（15）撕开塑料袋，弃除反应液，用漂洗液TBST（TBS100ml，纯水900ml，tween1ml），洗涤5min×3次，以除去过量的一抗。（16）将膜转入另一塑料袋中，按0.1ml/cm膜面积加入二抗羊抗兔IgG（1:3000），封口后室温下振荡孵育1h。（17）撕开封膜袋，反应液丢弃，将膜取出，TBST（TBS100ml，纯水900ml，tween1ml）洗涤5min×3次，以除去过量的二抗。（18）在PVDF膜上浸满ECL工作液（A液B液以1:1的比例混合）2min，之后将过多的液体丢掉，在暗室中曝光，压片用时1分钟，显影用时3分钟，定影用时1分钟，流水冲去多余的定影液。用图像分析仪对显示出的蛋白条带进行观察分析，并计算其表达量与GAPDH表达量的比值，即为此蛋白的相对表达量。1.1.10干湿比重法将取下的大脑用分析天平精确称重并记录重量数据，之后放置在100℃烤箱中直至恒重，然后记录恒定重量数据。A：脑组织称时的总湿重，B：烤后的恒重即干重，C：脑组织的含水量。计算公式：C=(A-B)/A×100%。-16- 第1章实验研究1.1.11统计学分析实验中所得的数据，对其进行分析，均以均数士标准差(xs)表示，利用SPSS17.0软件进行统计分析。TUNEL法、凋亡相关因子检测数据采用单因素方差分析，各组之间的两两比较采用LSD检验，各指标间的相关性选用皮尔森相关系数分析，P＜0.05认为有统计学意义。图表使用SPSS17.0软件制作分析。1.2结果1.2.1大鼠一般行为观察及体重变化1）一般行为观察饥饿前正常大鼠的精神状态良好，毛发有光泽，四肢肌肉丰满，行动灵活、协调，觅食行为主动活跃（图2）。饥饿3d和饥饿5d组大鼠的一般状态良好，体重有一定下降，皮下脂肪的蓄积量减少，但四肢肌肉较丰满，被毛有光泽，行动较灵活，协调，精神状态轻度兴奋，觅食行为主动活跃，但对外界刺激异常敏感，易激惹。在饥饿后期（饥饿7d、9d、11d组），大鼠的一般状况极度变差，体重下降明显，皮下脂肪急剧减少，四肢肌肉萎缩，被毛杂乱、稀疏、无光泽，活动减少，为减少能量的损耗，在笼中多呈蜷缩状，嗜睡，精神状态较萎靡，觅食行为差，对外界事物较冷淡，对刺激反应迟钝（图3）。图2正常对照组图3饥饿9天组Fig.2ThenormalcontrolgroupFig.3Thestarvation9daysgroup2）体重的变化大鼠开始用于实验时体重无差异，平均为350±30g，分笼适应性喂养两周后-17- 华北理工大学硕士学位论文进行实验。大鼠实验前严格按实验设计随机分组，饥饿前各组间大鼠体重经单因素方差分析，P值均＞0.05，表明各组大鼠间体重差异均无统计学意义。饥饿至相应天数时各组的体重与饥饿前同组相比，P值均＜0.01，即饥饿后与饥饿前大鼠体重差异有显著意义（表1）。表1各组大鼠体重的比较(克，均数±标准差)Table1Thecomparisonofbodyweightoneachgroupsofrats(g,xs)分组n饥饿前体重(g)饥饿后体重(g)正常对照组15455.58±27.97455.58±27.97△饥饿3d组15439.59±18.06393.21±17.40*△饥饿5d组15441.22±31.85369.07±18.65*△饥饿7d组15463.44±17.69352.31±31.58*△饥饿9d组15456.65±38.41321.23±45.95*△饥饿11d组15469.84±45.09309.96±21.94*△注：与对照组比较（P＞0.05）；与对照组比较*（P＜0.05）。1.2.2皮质区HE染色形态学比较结果取HE染色片，在光镜下对大鼠脑皮质顶叶区域细胞的形态变化进行观测察看。正常对照组：大鼠皮质区的细胞清晰饱满，形态完整，分布紧密规则，细胞质染色深，分布均匀，细胞核居中，有明显大量的神经纤维。饥饿3d组皮质顶叶区的神经细胞与正常组相似，饥饿5d组皮质区神经元细胞较正常对照组数量有所减少（图4-6）。图4正常对照组皮质区HE×400图5饥饿3d组皮质区HE×400Fig.4CortexofnormalcontrolgroupHE×400Fig.5Cortexofthestarvation3daysgroupHE×400-18- 第1章实验研究图6饥饿5d组皮质区HE×400Fig.6Cortexofthestarvation5daysgroupHE×400而饥饿7d组（图7）大鼠顶叶区细胞排列极其稀疏紊乱，细胞线不清，细胞间隙增宽，间质水肿疏松，神经元细胞丢失、细胞结构不清，尼氏体减少，细胞质染色淡。饥饿9d、11d两组（图8，9）皮质区可见细胞线不清晰，胞浆浓缩红色深染，核固缩或溶解、破碎，细胞内的结构破坏不整合，细胞肿胀、破裂，细胞坏死数量增多，细胞丢失明显，神经细胞排列稀疏不紧密，细胞间质水肿，细胞间的距离增宽，微循环的血管呈现条形的红色管型。图7饥饿7d组皮质区HE×400图8饥饿9d组皮质区HE×400Fig.7Cortexofstarvation7daysgroupHE×400Fig.8Cortexofstarvation9daysgroupHE×400图9饥饿11d组皮质区HE×400Fig.9Cortexofthestarvation11daysgroupHE×400-19- 华北理工大学硕士学位论文1.2.3各组大鼠皮质区神经细胞凋亡情况1）TUNEL法阳性细胞形态观察皮质区顶叶被TUNEL法标记和阳性表达的细胞，核染色呈棕黄色或棕褐色的颜色，形状和大小不一致；部分胞核固缩成团块状；部分胞核聚集在核膜的周边，表现典型的“指环样”或“半月样”细胞凋亡特征；部分胞核聚集形成数个小的团块；部分胞核分裂成三、四个小体，这些均符合细胞凋亡的特征。阴性对照皮质区无阳性凋亡细胞，正常对照组和饥饿3d组偶见凋亡细胞，饥饿5d组较正常对照组稍增多（图10-13）。图10阴性对照皮质区TUNEL×400图11正常对照组皮质区TUNEL×400Fig.10CortexofnegativecontrolTUNEL×400Fig.11CortexofnormalcontrolgroupTUNEL×400图12饥饿3d组皮质区TUNEL×400图13饥饿5d组皮质区TUNEL×400Fig.12Cortexofthestarvation3daysgroup(×400)Fig.13Cortexofthestarvation5daysgroup(×400)而饥饿7天组、饥饿9天组和饥饿11天组皮质区凋亡细胞的数目明显增多（图14-16）。-20- 第1章实验研究图14饥饿7d组皮质区TUNEL×400图15饥饿9d组皮质区TUNEL×400Fig.14Cortexofthestarvation7daysgroup(×400)Fig.15Cortexofthestarvation9daysgroup(×400)图16饥饿11d组皮质区TUNEL×400Fig.16Cortexofthestarvation11daysgroupTUNEL×4002）TUNEL法阳性细胞计数按照TUNEL法检测呈现的阳性细胞表达数，对其所得皮质区凋亡细胞百分比的数据进行单因素方差分析显示：与正常对照组相比，饥饿3d组的凋亡细胞，其所占总细胞的百分比差异无统计学意义（P＞0.05），饥饿5d组百分比稍有增加，差异有统计学意义（P＜0.05），而饥饿后期7d、9d、11d组百分比有显著的差异（P＜0.01）（表2）。表2大鼠皮质区的TUNEL阳性细胞及凋亡细胞阳性率（n=5,xs）Table2Thenumbersoftunelpositivecellsandpositiverateincortexregioninrats组别nTunel（个/hpl）凋亡细胞阳性率（％）正常对照组53.570.823.230.73饥饿3d组54.410.543.800.09饥饿5d组56.830.07*6.330.67*-21- 华北理工大学硕士学位论文表2（续）组别nTunel（个/hpl）凋亡细胞阳性率（％）饥饿7d组535.742.17**44.212.10**饥饿9d组543.632.72**51.592.36**饥饿11d组551.083.87**59.492.36**注：与对照组比较*（P＜0.05）；与对照组比较**（P＜0.01）。实验分析结果说显示在饥饿早期，即饥饿3天时大鼠皮质区神经细胞凋亡较少,饥饿5天时略有增加，而在饥饿后期，即饥饿7、9、11天时，大鼠皮质区凋亡细胞的数目明显增多。所以本实验结果显示饥饿可引起脑皮质区神经细胞凋亡数增加，饥饿后期数目明显增多，提示全饥饿状态促进大鼠皮质区神经细胞凋亡，可能已存在凋亡过度（图17）。图17大鼠皮质区的TUNEL阳性细胞数Fig.17Thenumbersoftunelpositivecellsincortexregioninrats1.2.4大脑皮质区在全饥饿状态下Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA表达结果bpM0d3d5d7d9d11dGAPDH200Caspase-3100-22- 第1章实验研究GAPDH200Bcl-2100GAPDH200Bax100图18各组大鼠皮质区Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA的表达水平（n=5,xs）Fig.18TheexpressionlevelofBcl-2,BaxandCaspase-3mRNAincortexofratsineachgroup与实验正常对照组比较得知，饥饿3d组Bax、Caspase-3mRNA表达增加不明显，差异无显著性（P＞0.05），而饥饿5d、7d、9d、11d组BaxmRNA、Caspase-3mRNA表达均显著增加（P＜0.01）；饥饿3d、5d、7d组Bcl-2mRNA的表达均增高（P＜0.05），5d组表达量最高（P＜0.01），9d、11d组表达降低（P＜0.05），11d组表达量最低（P＜0.01）（图18，表3）。表3大鼠皮质区Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA相对表达量（n=5,xs）Table3TheexpressionofBcl-2,BaxandCaspase-3mRNAincortex组别nBcl-2BaxBcl-2/BaxCaspase-3正常对照组50.7020.1090.3430.1262.2470.8880.3290.004饥饿3d组51.0200.000**0.4340.0702.3870.3590.3680.008饥饿5d组51.0300.005**0.9700.055#1.0640.065**0.7200.031▲饥饿7d组50.8060.086*1.0330.035#0.8120.025**1.0110.053▲饥饿9d组50.5640.067*1.0700.016#0.5270.057**1.1740.043▲饥饿11d组50.4060.001**1.1680.074#0.3490.023**1.2610.039▲注：与对照组比较*（P＜0.05），**（P＜0.01）；与对照组比较#（P＜0.01）；与对照组比较▲（P＜0.01）。▲▲#****##▲#*▲***图19大鼠皮质区Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA相对表达量（n=5,xs）Fig.19TheexpressionofBcl-2,BaxandCaspase-3mRNAincortex-23- 华北理工大学硕士学位论文1.2.5大脑皮质区在全饥饿状态下Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达结果0d3d5d7d9d11dActivedcaspase-317KDBcl-226KDActived17Bax17KDBGAPDH37KDB17图20各组大鼠皮质区Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达水平（n=5,xs）GAPDFig.20TheexpressionlevelofBcl-2,BaxandCaspase-3proteinincortexofratsineachgroup与正常对照组比较得知，饥饿3d组Bax、Caspase-3蛋白表达增加不明显，差异无显著性（P＞0.05），饥饿5d组Caspase-3蛋白表达增加（P＜0.05），Bax蛋白表达显著增加（P＜0.01），饥饿后期组7d、9d、11d组Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达均显著增加（P＜0.01），差异有统计学意义；饥饿3d、5d、7d组Bcl-2蛋白的表达均明显增高（P＜0.01），5d组表达量最高，9d、11d组表达降低，11d组表达量最低（P＜0.01）（表4，图20、21）。表4大鼠皮质区Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相对表达量（n=5,xs）Table4TheexpressionofBcl-2,BaxandCaspase-3proteinincortex组别nBcl-2BaxBcl-2/BaxCaspase-3正常对照组50.5800.0040.4990.0411.1620.0080.3610.005△饥饿3d组50.9900.0100.5330.0391.8580.018**0.3620.005△#饥饿5d组51.1680.0120.9580.0521.2190.013**0.3740.007*△#饥饿7d组50.7260.0071.1320.1120.6410.006**0.7730.006**饥饿9d组50.5770.0061.1450.112#0.5040.005**0.9260.006**△#饥饿11d组50.1650.0101.1880.1540.1380.008**1.2530.006**△注：与对照组比较(P＜0.01)；与对照组比较#(P＜0.01)；与对照组比较*(P＜0.05)，**(P＜0.01)。-24- 第1章实验研究#△##**△#**△***△图21各组大鼠皮质Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达水平（n=5,xs）Fig.21TheexpressionlevelofBcl-2,BaxandCaspase-3proteinincortexofratsineachgroup本实验中饥饿3d、5d组皮质区Bcl-2/Bax比值较正常对照组明显增加，而饥饿7d、9d、11d组较正常对照组相比明显下降（表4、图22）。图22各组大鼠皮质区Bcl-2/Bax比值变化Fig.22ThechangeofBcl-2/Baxratioincortexofratsineachgroup对细胞的凋亡数目与Bcl-2，Bax，caspase-3三种蛋白表达以及和Bcl-2/Bax比值之间的相关性联系进行分析（表5）。表5大鼠皮质区细胞凋亡与Bcl-2、Bax、Caspase-3及Bcl-2/Bax比值之间的相关性Table5TherelativitybetweenapoptosisandratioBcl-2/Baxincortexregioninrats与Bcl-2蛋白表达与Bax蛋白表与Bcl-2/Bax比与Caspase-3蛋相关性达相关性值相关性白表达相关性TUNELr=-0.600r=0.870*r=-0.829*r=1.000**阳性细胞注：*(P＜0.05)，**(P＜0.01)。-25- 华北理工大学硕士学位论文1.2.6大鼠脑组织含水量的变化与正常对照组相比，饥饿3d组脑组织含水量无明显增加，5d组含水量比例升高（P＜0.01），饥饿后期（7d、9d、11d）组均下降（P＜0.01）（表6、图23）。表6各组大鼠大脑含水量（n=5,xs）Table6Thebrainwatercontentinrats组别n脑组织含水量(%)正常对照组581.271.26饥饿3d组582.371.18饥饿5d组584.611.83*饥饿7d组579.050.03*饥饿9d组577.930.01*饥饿11d组575.690.78*注：与对照组比较*(P＜0.01)。********图23各组大脑组织含水量百分比Fig.23Thepercentageofwatercontentinbraintissue1.3讨论在人类中各种疾病引起的昏迷或其他原因长期不能进食，严重消化道疾病导致营养吸收障碍，或者某些灾难（如矿井、建筑物坍塌、野外迷路等）、自然灾害（如地震、海啸、山体滑坡等）发生时，常造成遇难人员得不到食物，以及人为的长期过度节食等均会造成不同程度的饥饿状态，而使机体处于一种急性饥饿危机。在较长时间饥饿状态下机体会启动应激反应，这种应激反应在保护机体的同时也会造成各个器官和系统的损伤，进而使消化、吸收、内分泌、泌尿等各种功能受到严-26- 第1章实验研究重影响[5-8]，影响机体的生理功能。饥饿是指食物供应有限甚至食物来源被切断，亦或是摄取食物的途径遭到影响破坏，进食困难甚至根本不能吃任何食物，使人体的能量和营养素摄入量不足或处于缺乏状态。如果身体不能摄入食物或没有食物的来源，这种情况被称为全饥饿状态；可以获得或摄入些许食物，但又不能完全满足机体需要的能量和营养素时，称为不完全饥饿状态。目前，国内对饥饿的研究多侧重于对胃肠道等消化系统以及能量代谢的影响[16,17]，然而对饥饿引起的相关激素、酶、基因表达[18-20]的相关研究则比较少见，而利用基因、蛋白技术，了解在饥饿情况下脑组织基因、蛋白表达的改变罕有报导。相关研究证明饥饿对神经系统的影响非常明显，因此饥饿状态可能因严重营养缺乏造成大脑组织结构和功能损害，从而影响患者脑功能的恢复。郝旭丽等人[12]发现细胞凋亡参与了饥饿性损伤的病理生理过程并发挥了重要作用。本研究通过对大鼠进行不同天数的饥饿处理，探讨饥饿对脑组织神经细胞凋亡及相关凋亡因子表达的影响，从而反映人类在不同饥饿时限时导致的不同饥饿程度是否对脑功能造成影响，以为有效地预防和救治因严重饥饿而造成的伤害建立理论基础，这对临床上判断饥饿事故对人体相关脑功能的伤害程度，确定恢复期治疗方案及预后具有指导意义。1.3.1全饥饿大鼠动物模型的制备饥饿分很多种状态如有氧、无水、无食，或者是有氧、有水、无食，甚至是缺氧状态下的无水、无食。而本实验的研究背景是以模拟无食物来源或意外事故被困人员的生存状态，在有氧、有水，但没有任何食物供给情况下机体的功能变化。本实验综合以往的实验方法与研究结果，动物模型的制备选择成年雄性的健康大鼠，人工保证水源充足、有氧的较适宜生存环境，但无食物供给。成功的全饥饿大鼠模型是本实验研究结果具有科学性和可信度的基础。本实验通过制备全饥饿模型，研究大鼠全饥饿后脑组织神经细胞凋亡以及相关凋亡因子Bcl-2，Bax，Caspase-3随时间而发生的动态变化并分析其相关性，以推测饥饿后Bcl-2，Bax的表达对神经细胞凋亡的影响，探讨饥饿时限对脑组织损害程度及机制的影响，并试图寻找到治疗的靶点和时间窗。1.3.2全饥饿状态对大鼠一般状况及体重的影响在全饥饿状态下机体无法摄入食物或得不到任何来源的食物，此时机体所需的能量和营养物质有限或者缺乏，必须通过使用自己的能源储备来满足自身的能量和-27- 华北理工大学硕士学位论文营养需求。机体内部储备的能源物质主要有三大类：糖原、蛋白质、脂肪，此外尚有一些游离葡萄糖、氨基酸等等。后者这些物质提供的能量很小，身体只会持续很短的时间，所以身体所需要的能量和营养素主要依赖于三个主要的能源物质。当没有额外的食物摄入时，身体慢慢适应，主要的代谢来源就为沉积在脂肪组织的甘油三酯和储存在平滑肌、心肌、骨骼肌中的氨基酸。当饥饿持续存在时，蛋白是机体唯一的能量来源，机体将葡萄糖的利用量减少到最小，细胞代谢率明显下降以维持其整体的生存[25-27]。在本实验的观察记录中可见饥饿早期，即饥饿3d、5d组大鼠的一般状态良好,体重有一定下降，皮下脂肪的蓄积量减少，但四肢肌肉较丰满，被毛有光泽，行动较灵活、协调，精神状态轻度兴奋，觅食行为增加，但对外界刺激异常敏感，易激惹。相关的研究结果显示，一定程度的饥饿会导致机体神经内分泌活动增强，调动身体的潜能，让身体在高应力状态。当受到外界刺激时，使机体能够在短期内做好应变反应。因此在饥饿早期，人和动物的注意集中能力不仅没有减少，而且在一定程度上有所增强[28]。但是这种能力的提高具有一定程度和一定时间范围限制。正如本实验中表现一样，随着饥饿时间的延长，即饥饿后期(饥饿7d、9d、11d组)大鼠精神状态逐渐萎靡，毛发光泽度下降，脱毛增多，鼠尾逐渐变的苍白无血色。表现为安静、嗜睡，活动度减少到最低，减少能力消耗以维持更长的生命时间，但有的仍最终走向死亡。一般认为这主要是因为随着饥饿时间的延长，机体能量供应不足，导致正常的生理机能下降，甚至是导致死亡。研究发现动物饥饿时，首先表现为水分丢失，消化和吸收过程受到抑制，为维持身体的基础代谢，大量糖原的消耗，脂肪的动用，以保证机体各器官正常的功能，在这个过程中动物的体重也急剧下降。在本实验中动物饥饿3d时体重下降10.55％，饥饿5d时体重下降16.35％，饥饿7d时体重下降23.98％，饥饿9d时体重下降29.66％，饥饿11d时体重下降34.03％。1.3.3全饥饿状态对大鼠皮质区神经细胞凋亡的影响细胞凋亡，即细胞在一定的生理或病理(如某些肿瘤、外伤)情况下的主动死亡过程，由多个基因精确调控，有其自身的程序，是重要的机体自稳调节机制[21,22]，它是受基因和细胞内部、外部的一些因素调节的复杂的生物学过程。细胞凋亡具体表现为：细胞体积缩小、皱缩，与周围的细胞脱离；凋亡小体出现；凋亡小体及其四周死亡的细胞迅速的被巨噬细胞所吞噬，无炎症反应；线粒体膜电位降低，出现损伤，线粒体通透性改变，凋亡相关蛋白释放到细胞质中；染色-28- 第1章实验研究质沿核膜缩合，逐步集成新月状；核仁破裂，核膜包裹其碎片，DNA断裂，裂解为180-200bp片段，琼脂糖凝胶电泳条带显示特征性阶梯状[29-33]。本实验研究结果，皮质区顶叶被TUNEL法标记和阳性表达的细胞，核染色呈棕黄色或棕褐色的颜色，形状和大小不一致；部分胞核固缩成团块状；部分胞核聚集在核膜的周边，表现典型的“指环样”或“半月样”细胞凋亡特征；部分胞核聚集形成数个小的团块；部分胞核分裂成三、四个小体，均符合细胞凋亡的特征。本研究结果显示，与正常对照组比较，饥饿3d组凋亡细胞百分比差异无统计学意义（P＞0.05），饥饿5d组稍有增加，差异有统计学意义（P＜0.05），而饥饿7d、9d、11d组，有显著差异（P＜0.01）。实验结果说明在饥饿早期，即饥饿3天时大鼠皮质区神经细胞凋亡较少，饥饿5天时略有增加，而在饥饿后期（即饥饿7、9、11天）时，大鼠皮质区凋亡细胞的数目明显增多。所以本实验结果显示饥饿可引起脑皮质区神经细胞凋亡数增加，饥饿后期数目明显增多，提示全饥饿状态促进大鼠皮质区神经细胞凋亡，可能已存在凋亡过度。1.3.4全饥饿状态下Bcl-2、Bax、Caspase-3三种因子在皮质凋亡中的调控作用至今为止，针对细胞凋亡机制的研究有30余年，关于细胞凋亡的庞大复杂过程也有了一定的了解，但其凋亡过程中的确切机制我们尚没有完全弄清楚。至今的研究结果表明[34]，细胞凋亡可能存在3个主要的信号通路，即死亡受体、线粒体和内质网通路[35]。Bcl-2家族蛋白被公认为是调节细胞凋亡的关键因子，其有抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，它们在细胞凋亡中确切的调控机制仍是现今科学研究和争论的一个热点话题。根据Bcl-2基因家族的结构和功能可以分为三类：第一类是Bcl-2亚家族，包括：Bcl-2、Mcl-l等，他们通常都含有BH1至BH4四个同源结构域，第四种结构域(BH4)是一种对抗细胞发生凋亡的蛋白特有的区域[36]；第二类是Bax亚家族，包含三个结构域BH1至BH3，能促进细胞的凋亡；第三类是仅含有BH3特殊结构域的亚家族，促进细胞发生凋亡，包括bad、bid等，BH3结构域被认为是在细胞凋亡调控中必不可少的致死性的结构域，发挥着关键性的作用[37]。近年来研究已发现Bcl-2基因家族、Caspase家族在细胞凋亡的调控作过程中具有重要作用[28,38]。1）凋亡相关基因Bcl-2Bcl-2存在于细胞内的线粒体和内质网（ER）2个不同区域中。在线粒体中，Bcl-2蛋白可以通过其疏水性支架Bcl-2同源结构域（BH3），发挥BCL-2家族成员类促凋亡作用，小分子（如BH3类似物）可以致使细胞发生凋亡[39]。而Bcl-2-29- 华北理工大学硕士学位论文至少在三个层次上发挥着抑制凋亡作用：（1）通过促使位于线粒体外膜上PT孔上的复杂结合物的释放[40-43]，阻遏细胞色素C、凋亡诱导因子AIF和其他促凋亡蛋白的释放，防止细胞凋亡的进展；（2）抑制谷胱甘肽的对外流出，控制线粒体的膜电位通过减少抗衡线粒体巯基氧化还原状态来达到，从而调控抑制细胞凋亡；（3）经过介导与半胱天冬酶的间接效应，使Apaf-1基因（凋亡蛋白酶活化因子）到线粒体膜上，调控凋亡蛋白酶结构，并防止其被激活，从而阻止细胞色素C释放，使细胞免于死亡[44]。Bcl-2在内质网中调节Ca2+的信号转导，从而促进细胞增殖，增加抗凋亡作用，其抗凋亡作用主要是与细胞内钙离子浓度有关[45]。它通过其N-末端BH4域，直接结合并抑制肌醇1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP3R），来调节控制细胞内主要的Ca2+释放通道。内质网中的Ca2+在细胞早期凋亡时持续释放，导致细胞质中的Ca2+浓度继续升高，其作为一个启动凋亡的信号，引起细胞发生凋亡[46]。相关人员[47]发现，由于K+调节引起的Ca2+浓度升高[48]可以通过Bcl-2高表达而得到抑制，并且当使用Bcl-2抑制剂后这种抑制作用消失。对转基因方法的应用研究发现，Bcl-2蛋白的高表达可抑制Ca2+从内质网的膜转运到胞浆，降低了依赖于钙离子的核酸内切酶的活性，使胞浆内Ca2+浓度达到稳定状态，从而抑制细胞凋亡。同时在某些癌细胞中发现[39]，如CLL细胞和DLBCL细胞，作用机制主要是针对Bcl-2的BH4域，通过抵抗Bcl-2在IP3Rs和Ca2+信号传导中的抑制作用，来抑制细胞发生凋亡。目前关于Bcl-2与细胞信号传导的相关研究发现，它可被Raf激酶所激活，又可活化R-ras和R-ras相关活性区域，而Raf和Bcl-2基因都是可以抑制细胞凋亡的，但是raf癌基因与细胞信号转导有关，因此目前认为Bcl-2可能调控细胞信号的转导途径。本研究显示，饥饿7天内大鼠Bcl-2基因的表达增加，而随着饥饿期延长，Bcl-2的表达明显减少。结果表明短期的饥饿应激后皮质神经细胞中Bcl-2被诱导表达，提示Bcl-2可能是成年脑组织中的一种可诱导的内源性神经保护剂，相关研究证明饥饿早期时大鼠学习记忆能力稍有增强[12]。Bcl-2蛋白在内源性凋亡调控途径中起着重要的作用[49,50]，其可改变降低细胞膜通透性、阻遏线粒体释放Cyt-c、减少钙离子在内质网中释放等等，以防止细胞发生凋亡[51,52]。而饥饿后期Bcl-2表达减少可能会是皮质区神经细胞凋亡增加的影响因素之一。2）凋亡相关基因BaxBax具备使孔形成的能力，还能诱导并释放细胞色素C，使Bcl-2与Apaf-1分离，然后Apaf-1激活Caspase[53,54]，启动凋亡级联反应[53]。饥饿3d时大鼠Bax基因的表达略有增加，而随着饥饿期延长大鼠皮质区Bax基因的表达明显增加。-30- 第1章实验研究结果提示在全饥饿状态下Bax的表达受到影响，结合Bax基因表达具有促进凋亡的作用，考虑全饥饿状态下皮质区细胞凋亡增加可能与Bax表达增加相关，而相关性分析显示二者呈正相关。3）凋亡相关基因Caspase-3Caspase家族中，caspase-3也被称为CPP32，在正常情况下以无活性的酶原形式存在，是一个更深入的研究细胞凋亡的发生、发展密切联系的凋亡相关基因[55,56]。迄今为止研究以为，caspase-3为哺乳动物在细胞凋亡调控中的关键酶，位于凋亡途径中的核心地位，即又被称为死亡执行蛋白酶[57-58]。激活有2种主要方式：一是通过细胞膜表面受体的激活；另一种是线粒体受到死亡刺激因子的刺激影响，使细胞色素c被释放出来。当凋亡相关因素刺激细胞时，它发生了一系列反应的活化，其他的Caspase成员被活化的caspase-3激活后，继而呈现出瀑布样的激活，并诱导细胞凋亡[59]。被激活的caspase-3酶对DNA-PK、PARP等进行降解、切割，从而影响DNA复制、转录和损伤修复[60]。大鼠皮质Caspase-3基因表达的结果比较显示，与正常对照组相比，其他组均明显上调Caspase-3的表达，Caspase-3活性增加，其在饥饿后期7d、9d、11d组中变化更显著，故可知饥饿后期更容易诱导细胞凋亡。4）Bcl-2/Bax比率与细胞凋亡的相关性Bcl-2和Bax蛋白能结合成特异性构型二聚体，抑制细胞凋亡，而Bax过表达可以阻遏Bcl-2的抗凋亡作用，可促进细胞凋亡，双方既能相互竞争又能各自调控细胞凋亡[61]。目前有研究认为，Bcl-2与Bax的比值是决定细胞是否发生凋亡的基本检验点[62]。在不同刺激因素的影响下，决定细胞存活的关键调控机制可能就是Bcl-2家族成员彼此间的平衡稳态，尤其是此家庭成员中的代表Bcl-2和Bax。当两者比例小于1，Bax起主导作用，诱导细胞色素C的释放，从而导致一系列级联反应的细胞凋亡发生；当二者比率≥1，Bcl-2起到的作用占优势，细胞色素C不再释放，线粒体途径的凋亡不起作用，细胞凋亡因此大大减少[63,64]。本实验中饥饿3d、5d组皮质区Bcl-2/Bax比值较正常对照组明显增加，而饥饿7d、9d、11d组较正常对照组相比明显下降。本研究结果说明，在全饥饿状态下的早期，皮质区表达的Bcl-2/Bax比例升高明显，阻遏细胞凋亡，而在其后期二者比值显著降低，细胞凋亡数增加，相关性分析显示凋亡细胞数与二者比值呈负相关。在不同疾病模型研究中，TUNEL阳性细胞数的增加或减少与Bcl-2/Bax两者比值显示呈互相变化平行的干系，说明Bcl-2/Bax比值有可能成为判断细胞凋亡程度及与相关疾病发生有关的一个预示指标。-31- 华北理工大学硕士学位论文大鼠饥饿性脑损伤能够诱发Bax、caspase3表达增加，bcl-2先增后降，短期饥饿应激可能有一定的脑保护作用，表明在全饥饿早期给予积极的预防和治疗可以有效的防治脑相关区域功能的减退。而长期饥饿应激引起大量皮质细胞凋亡，导致脑功能受损直至衰竭，此时应积极抢救治疗以挽救生命。1.3.5全饥饿状态对大鼠脑组织重量的影响有关全饥饿状态下肠道屏障功能、应激障碍、行为与记忆功能研究发现，实验大鼠于第7天时突然死亡，这可能是因为对于进行性低血容量性休克自我调整的缘故，通过减少肠道、肝脏、皮肤等循环血量以维持大脑内血循环和能量供应，一旦脑细胞出现缺血、脱水，立即会呈现“瀑布样”衰竭而死亡[65]。本实验结果显示，饥饿5d时以脑水肿为主，而饥饿后期（7d、9d、11d）主要以脑组织脱水为主，这与前人研究结果相一致[65]。当脑组织发生缺血、缺氧并且继续存在，细胞内的能量代谢发生衰竭，致使主要能源物质-ATP产生减少，细胞内各种离子稳态平衡遭到破坏，离子浓度梯度紊乱，最终脑组织发生水肿。而随着饥饿时间的延长，脑组织缺血缺氧继续恶化时，会陆续发生糖无氧酵解增加、乳酸蓄积、组织能量急剧下降。能量衰竭的最终结果是，出现一系列的瀑布反应从而造成脑组织损伤，如细胞内钙离子超载、脑组织血流量调节障碍等等，最终导致细胞水肿和凋亡、坏死等等，大脑重量的变化在一定程度上提示大脑功能可能已经受到影响。1.4小结1）全饥饿状态下大鼠皮质区神经细胞凋亡增加从饥饿第5天开始发生，后期增加明显。2）在全饥饿状态下，短期饥饿应激可能有一定的脑保护作用，而长期饥饿应激则引起大量皮质细胞凋亡，导致脑功能受损，应给予积极预防和治疗，改善脑功能。3）在全饥饿状态下，Bcl-2、Bax两种因子在大鼠皮质细胞凋亡调控中起着较重要的作用。参考文献[1]ChinnakaliP,UpadhyayRP,ShokeenD,etal.Prevalenceofhousehold-levelfoodinsecurityanditsdeterminantsinanurbanresettlementcolonyinnorthIndia[J].JHealthPopulNutr,2014,32(2):227-36.[2]DeOnisM,BlössnerM,BorghiE.Prevalenceandtrendsofstuntingamongpre-schoolchildren[J].Public-32- 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第2章综述第2章综述凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3在细胞凋亡中的作用及其相互关系细胞凋亡是重要的机体自稳调节机制，如果凋亡调控紊乱的话，可以导致多种疾病，例如癌症、神经退行性疾病[1]。在各异的环境或刺激条件下，细胞可以有不同的凋亡路径，这就使细胞凋亡和调节机制及其复杂化。在过去的几年中进行的研究已经证明，细胞发生凋亡有两个主要的凋亡途径—内、外源性凋亡途径[2]，细胞凋亡的内在途径是DNA损伤反应所触发的[3]，细胞凋亡诱导剂，如紫外线（UV）和星形孢菌素（STS）诱导的细胞凋亡主要是通过内部通道[4,5]，而细胞凋亡的外在途径是死亡受体成员（TNF超家族，包括TNF-α和TRAIL）介导的[2,6]，内源性和外源性死亡受体途径是最终的实施执行阶段。近年来更多的是研究内源性线粒体通路，在该通路上又发现了新的相关蛋白[7]，对细胞的生存机制而言，线粒体途径在基因调控中起着关键的作用。在细胞凋亡的调控因子中，Bcl-2家族和半胱天冬酶家族是当前备受关注的，其中凋亡相关因子bcl-2和bax是彼此对立的两个最重要的调控因子。Caspase-3，6，7是半胱天冬酶，水解底物PARP、细胞角蛋白和其他，并最终导致细胞凋亡的形态生化变化[8-10]，在细胞凋亡的调控过程当中，caspase-3是最关键的细胞凋亡蛋白酶。在细胞凋亡的过程中三者之间的关系已成为细胞凋亡研究的一个热点问题，将对其进行简要概述。2.1凋亡概述细胞凋亡，即细胞在一定的生理或病理（如某些肿瘤、外伤）情况下的主动死亡过程，由多个基因精确调控，有其自身的程序，是重要的机体自稳调节机制[1,11]。它是受基因和细胞内部、外部的一些因素调节的复杂的生物学过程，细胞凋亡具体表现为：细胞体积缩小、皱缩，与周围的细胞脱离；凋亡小体出现；凋亡小体及其四周死亡的细胞迅速被巨噬细胞所吞噬，无炎症反应；线粒体膜电位降低，出现损伤，线粒体通透性改变，凋亡相关蛋白释放到细胞质中；caspase级联反应被激活，核固缩，染色质沿核膜缩合，核仁破裂，DNA断裂，裂解为180-200bp片段，琼脂糖凝胶电泳条带显示特征性的阶梯状[12-16]。-37- 华北理工大学硕士学位论文2.2细胞凋亡信号传导途径至今的研究结果表明[17]，细胞凋亡可能存在3个重要的信号通路，即死亡受体、线粒体、内质网通路[18]。2.2.1死亡受体信号通路细胞凋亡的死亡受体（I型跨膜蛋白），有将蛋白水解之功能，称之为“死亡区”（死亡结构域，DD）[19]，它是含有丰富的半胱氨酸胞外结构域，在胞质区约有70个氨基酸组成的周围的辅助结构。在受体介导的死亡受体信号转导的蛋白联合中，最典型的受体有TRADD（TNF受体相关死亡域蛋白）和FADD（Fas相关死亡域蛋白）。当配体与死亡受体结合后，FADD和TRADD被募集吸引，和caspase-8或前体caspase-10基因诱导细胞凋亡的信号复合物的形成，启动caspase级联反应，诱导细胞凋亡的发生[20,21]。2.2.2线粒体途径线粒体并不是完全自立的细胞器，而是半自主的细胞器[22]。线粒体在细胞内能有效将直接能源ATP转化为进行生命活动细胞所需要的能量，维持细胞正常生理功能[23]。除了为细胞提供能量外，线粒体也参与细胞分化、信号转导和细胞凋亡，并且对细胞生长和细胞周期也有调控的能力。其超微结构和功能是密切相关的，线粒体具有封闭的双层单位膜，外膜上面有各种功能蛋白,内膜上有ATP酶复合体等。在调节细胞生命活动的多种调控因素中，线粒体居于中心位置，一些人提出了其在细胞凋亡过程当中具有决定性的作用[24]。脑损伤后，细胞失去了赖以生存的生长因子或激素的支持，或从原来的生长环境中脱离，将诱导线粒体介导的细胞凋亡途径。细胞色素C、半胱天冬酶、AIF等多种凋亡相关蛋白存在于线粒体内膜中[25,26]，细胞色素C是第一个被发现的线粒体凋亡因子，生理状态下，细胞色素C存在于线粒体膜间隙，参与呼吸链电子传递[27]。当细胞凋亡启动时，细胞色素C从线粒体进入胞浆[28]，在脱氧三磷酸腺苷（dATP）参与的情况下，它和pro-Caspase-9、凋亡诱导因子1连系构成凋亡多聚体，即凋亡复合体[29,30]，凋亡复合体激活Caspase级酶联反应，随后caspase-9，caspase-3和PARP被顺序激活[31-33]，并活化下游的Caspase，通过调节caspase依赖的凋亡途径最终导致细胞凋亡[34]。-38- 第2章综述2.2.3内质网通路内质网（endoplasmicreticulum，ER）存在于真核细胞，是一种重要的细胞器，其基本的生理功能是调节钙离子、合成处理生物大分子等。在ER中的质量控制系统，通过未折叠蛋白反应（UPR）[35,36]和内质网相关降解（ERAD）以保证细胞功能和有机体的生存。严格调控的信号转导途径维持着ER蛋白折叠的平衡，然而，某些ER状态与细胞存活不相容，此时UPR可以选择通过细胞凋亡来消除严重的破坏细胞，这主要是通过对转录因子、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的激活来完成。现今关于内分泌相关的肿瘤问题，从南卡罗来纳大学和雅典（希腊）研究人员的研究结果来看，他们发现了关于CHOP介导的细胞凋亡的新的分子机制与能抑制细胞周期调控的具有抗细胞凋亡活性的蛋白，p21[37]。这些调查结果为在临床疾病的治疗中，如癌症、2型糖尿病，研究新的治疗方法提供了理论依据。Nakagawa[38]发现caspase-12存在于内质网，若内质网钙稳态损坏或过量的蛋白质积累在这里可以激活Caspase-12，活化的caspase-12能够剪切caspase-3，可进一步引发细胞产生凋亡。ER非常敏感,蛋白的异常转运、糖和其他营养素的不足等刺激因素可以致使ER的功能发生障碍，即内质网应激（ERS），此时ER内的蛋白不能正确折叠，而导致大量滞留，引起UPR，激活内质网和高尔基体、细胞核间信息的传导，抑制蛋白质的合成，并开启ERS相关基因的转录。ERS在一定程度时可以加强ER的应激能力，增进ER功能的恢复，但若ERS继续存在甚至应激过强时，会引起ERS相关细胞的凋亡（ERAD），引起组织损伤。这个过程是由内质网失常引起的，而不是由膜或线粒体凋亡信号所触发的。2.3Bcl-2蛋白家族与细胞凋亡2.3.1Bcl-2蛋白家族的分类、结构与功能Bcl-2家族被公认为是细胞凋亡的重要调节蛋白，其中有抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，它们在细胞凋亡中确切的调控机制仍是现今科学研究和争论的一个热点话题。这个基因家族由决定蛋白质的亚细胞定位的的羧基末端疏水性跨膜区（TM）和不同数量的Bcl-2的同源结构域组成。根据Bcl-2基因家族的结构和功能可以分为三类：第一类是Bcl-2亚家族，包括：Bcl-2、Mcl-l等，他们通常都含有BH1至BH4四个同源结构域，第四种结构域（BH4）是一种对抗细胞发生凋亡的蛋白特-39- 华北理工大学硕士学位论文有的区域[39]；第二类是Bax亚家族，包含三个结构域BH1至BH3，能促进细胞的凋亡；第三类是仅含有BH3特殊结构域的亚家族，促进细胞发生凋亡，包括bad、bid等，BH3结构域被认为是在细胞凋亡调控中必不可少的致死性的结构域，发挥着关键性的作用[40]。近年来研究已发现Bcl-2基因家族在细胞凋亡的调控作过程中具有重要作用[41,42]。关于Bcl-2基因的报道研究将近有30年，然而至今，人们仍然能从其结构和功能的多样性的Bcl-2蛋白家族集团中得到新的意外发现。虽然大量的工作已经证实了线粒体在凋亡中的作用，但越来越多的研究也指出内质网在这一过程中也有其调控机制。有趣的是，Bcl-2家族蛋白之所以能在凋亡控制中起着至关重要的作用，可能跟它定位于线粒体和内质网密切相关，并且它们也调节内质网和线粒体内的钙离子稳态。钙作为第二信使可以诱导细胞凋亡，并且可以通过不同的途径来诱导调节。大多数的Bcl-2家族成员不仅参与细胞凋亡的调控，还参与其他重要的细胞生理过程简单称为“非凋亡功能”。目前研究认为，Ca2+稳态的调控可能是这些非凋亡作用的共同机制[43]。因此，若我们想要完整、全面的了解Bcl-2家族在所有细胞生命过程中所起的作用，那么我们的研究还远远不够，在这里我们仅简要概述。1）Bcl-2的结构及功能Bcl-2作为抗凋亡基因的代表，是首个被发现证实的抗凋亡因子，是在凋亡信号转导通路中细胞发生凋亡的关键调节因素。Bcl-2蛋白由239个氨基酸残基、19个疏水氨基酸片段结合而成，和CED-9基因有23%的同源性，位于21区18号染色体上，有3个外显子和2个内含子，定位在线粒体外层膜、外核膜和内质网的部分表层[41]，编码26kD和22kD的线粒体膜蛋白bcl-2α、bcl-2β，据目前研究来看主要是Bcl-2α蛋白发挥着抑制细胞凋亡的作用[44]。除了其典型的抗凋亡作用，Bcl-2对细胞周期也有抑制作用[45]。Bcl-2通过促进改变细胞的存活来影响肿瘤等疾病的发展进程，因此，它成为了一种新型特异性抗癌治疗的首要目标。2）Bax的结构及功能Bcl-2家族控制细胞凋亡过程中线粒体的通透性，而在此家族中Bax是紧要的促凋亡成员。它有6个外显子、5个内含子，位于q13.3～q13.4区19号染色体上，编码6种Bax蛋白α，β，γ，δ，ε和σ亚型，其中Baxα具有生物活性。Baxα蛋白由192个氨基酸残基组成，和Bcl-2基因有21%的同源性，位于C端的保守区，分子量21kD，它为Bax蛋白发挥促凋亡作用所呈现的主要表现方式。在细胞凋亡调控中，Bax被招募到线粒体并被激活，而在此过程发生时线粒体-40- 第2章综述磷脂似乎也参与其中。Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax和Bak等成员负责破坏线粒体外膜的完整性，从而使凋亡因子包括细胞色素c释放，激活细胞内的半胱天冬酶，而Bak在激活凋亡过程中具体如何表达、调控，我们目前尚不完全了解，tBid和线粒体磷酸磷脂之间的相辅作用被认为是促进Bax或Bak低聚体生成的影响因素[46]。2.3.2Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡中的调控机制1）Bcl-2在细胞凋亡中的调控机制Bcl-2蛋白存在于细胞的线粒体和内质网（ER）在2个不同的区域。在线粒体中，Bcl-2蛋白可以通过其疏水性支架Bcl-2同源结构域（BH3），发挥Bcl-2家族成员类促凋亡作用，小分子（如BH3类似物）可以致使细胞发生凋亡[45]。而Bcl-2至少在三个层次上发挥着抑制凋亡作用：（1）通过促使位于线粒体外膜上PT孔上的复杂结合物的释放[47-50]，阻遏细胞色素C、凋亡诱导因子AIF和其他促凋亡蛋白的释放，防止细胞凋亡的进展；（2）抑制谷胱甘肽的对外流出，控制线粒体的膜电位通过减少抗衡线粒体巯基氧化还原状态来达到，从而调控抑制细胞凋亡；（3）经过介导与半胱天冬酶的间接效应，使Apaf-1基因（凋亡蛋白酶活化因子）到线粒体膜上，调控凋亡蛋白酶的构型，并防止其被激活，从而阻止细胞色素C释放，使细胞免于死亡[42]。Bcl-2在内质网中调节Ca2+的信号转导，从而促进细胞增殖，增加抗凋亡作用，其抗凋亡作用主要是与细胞内钙离子浓度有关[51]。它通过其N-末端BH4域，直接结合并抑制肌醇1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R），来调节控制细胞内主要的Ca2+释放通道。内质网中的Ca2+在细胞早期凋亡时持续释放，导致细胞质中的Ca2+浓度继续升高，其作为一个启动凋亡的信号，引起细胞发生凋亡[52]。相关人员[53]发现，由于K+调节引起的Ca2+浓度升高可以通过Bcl-2高表达而得到抑制，并且当使用Bcl-2抑制剂后这种抑制作用消失。对转基因方法的应用研究发现，Bcl-2蛋白的高表达可抑制Ca2+从内质网的膜转运到胞浆，降低了依赖于钙离子的核酸内切酶的活性，使胞浆内Ca2+浓度达到稳定状态，从而抑制细胞凋亡。同时在某些癌细胞中发现[45,54]，如CLL细胞和DLBCL细胞，作用机制主要是针对Bcl-2的BH4域，通过抵抗Bcl-2在IP3Rs和Ca2+信号传导中的抑制作用，来抑制细胞发生凋亡。DLBCL细胞的敏感性与定位在BH4域的IP3R2通道的表达水平密切相关，其IP3R异构体与IP3有很高亲和力。有趣的是，在一个初级的CLL患者的细胞数据库的生物信息学分析中还显示，此类细胞可转录上调IP3R2[45]。目前关于Bcl-2-41- 华北理工大学硕士学位论文与细胞信号传导的相关研究发现，它可被Raf激酶所激活，又可活化R-ras和R-ras相关活性区域，而Raf和Bcl-2基因都是可以抑制细胞凋亡的，但是raf癌基因与细胞信号转导有关，因此目前认为Bcl-2可能调控细胞信号的转导途径。3）Bax在细胞凋亡中的调控机制Bax蛋白分布在细胞质中，大多数以非活性单体方式存在。只有当Bax在细胞发生凋亡接收到凋亡信号时，被招募到线粒体并被激活发生分子异构，其结构发生转变后插入线粒体外膜形成Bax大孔[46]，破坏线粒体外膜的完整性，从而使凋亡因子包括细胞色素c释放，激活细胞内的半胱天冬酶，并拮抗Bcl-2等相关抑制凋亡的蛋白，防止其发生抗凋亡的作用[55]。2.4Caspase蛋白与细胞凋亡2.4.1Caspase蛋白家族的分类、结构与功能Caspase家族位于细胞质，是一类半胱天冬酶，在诱导细胞发生凋亡的分子机制中起着至关重要的作用[56]，是多种凋亡调控通道的汇集点，是最终执行凋亡的途径[57-59]。到目前为止这个蛋白家族在哺乳动物中已经发现了14种以上不同性质的成员，其中至少有8个与细胞凋亡有关[60]。Caspase蛋白酶可依据凋亡发生时的结构和功能分三类：第一是凋亡启动子类：包括caspase-2，8，9，10，这个子类的蛋白酶在级联反应的上游，原域有一个长的结构，可以激活参与反应的下游caspase蛋白酶[61]；第二类是凋亡效应子类：包括Caspase-3，6，7，在级联反应的下游，一般是比较小的分子，蛋白结合结构域缺失，可以对细胞结构蛋白进行剪切，即直接使细胞发生凋亡[62]；第三类是炎症相关的亚型[63]，包括Caspase-1，4，5，12等，主要是介导促炎性因子的成熟，在细胞发生凋亡的调控过程当中起到一些辅助作用。Caspase家族的成员共有以下特点：在细胞质中caspase无活性，以30～50kD酶原的形式存在，由N端前域和两个大小不同的亚基组成的C端酶作用域所构成；小亚基是通过蛋白水解激活活性，分解成四聚体的异构模式；在催化区域上含有五肽的特异性序列；在N端的基板切割位点的天冬氨酸特异性高；酶的活性是依赖嗜核性的半胱氨酸残基；半胱天冬酶能自我活化和激活细胞凋亡的过程，一旦触发，即为级联放大的方式；细胞内的半胱天冬酶及其抑制剂型在正常情况下是共存的，就是为了避免意外激活酶原对正常细胞造成的损害。细胞凋亡是一种蛋白酶级联反应过程，由caspase家族成员介导，即半胱天冬-42- 第2章综述酶在诱导凋亡信号的作用下，启动半胱天冬酶的辅因子去特异水解蛋白，发挥作用，从而激活半胱天冬酶的下游效应，一旦效应半胱天冬酶被激活，那么目标物质便被广泛的在细胞内水解，细胞内蛋白被降解，最终导致不可逆的细胞死亡[64]。2.4.2Caspase-3在细胞凋亡中的作用机制Caspase家族中，Caspase-3也称CPP32，正常情况下为无活性的酶原形式存在，是一个更深入的研究细胞凋亡的发生、发展密切联系的凋亡相关基因[64,65]。迄今为止研究以为，caspase-3为哺乳动物在凋亡调控中的关键酶，位居凋亡途径中的核心地位，即又被称为死亡执行蛋白酶[65,66]。激活有2种主要方式：一是通过细胞膜表面受体的激活；另一种是线粒体受到死亡刺激因子的刺激影响，使细胞色素c被释放出来。当凋亡相关因素刺激细胞时，它发生了一系列反应的活化，其他的Caspase成员被活化的caspase-3激活后，继而呈现出瀑布样的激活，并诱导细胞凋亡[67]。被激活的caspase-3酶对DNA-PK、PARP等进行降解、切割，从而影响DNA复制、转录和损伤修复[68]。2.5Bcl-2、Bax、Caspase-3三者在细胞凋亡中的相互作用关系细胞在发生凋亡的过程当中能够归纳为三个阶段，即诱导发生凋亡、执行凋亡调控、产生效应阶段。近年来的研究证实，细胞凋亡的发生至少涉及线粒体、死亡受体、内质网通路三条途径[69]。其中，在凋亡调控通路中主要的传导途径是线粒体通道，主要的信号传导途径是JNK通路。细胞色素C是线粒体电子传递链的重要组成部分，其从线粒体释放出来启动凋亡是关键步骤[70]。Bcl-2，Bax基因是Bcl-2家族中最重要的细胞凋亡调节基因，可以介导cytc等物质经过线粒体途径得到释放，而对级联反应下游中最关键的凋亡执行者—Caspase-3来说，它在很大的程度上都依赖细胞色素C的释放而使本身活化。最近几年来，随着更深层次研究caspase-3、Bcl-2、Bax三种因子在细胞凋亡信号转导中的关系，我们发现bcl-2、bax两因子不单能够作为caspase-3的上游调控因素参与对caspase-3活性的调节[71]，它们也可以用来作为直接的caspase-3的效应底物，激活其下游的因子，它们在细胞凋亡传导途径中密不可分，既相互制约又相互联系。2.5.1Bcl-2、Bax蛋白间的相互作用关系Bcl-2和Bax蛋白能结合成特异性构型二聚体，抑制细胞凋亡，而Bax过表达可以阻遏Bcl-2的抗凋亡作用，可促进细胞凋亡，双方既能相互竞争又能各自调控-43- 华北理工大学硕士学位论文细胞凋亡[72]。高分辨率的三维结构研究表明，Bcl-2，Bax蛋白，在两个同源结构域-BH1，BH2，可以形成一个疏水槽，各自通过N端α螺旋区域的静电和疏水的相互作用形成同型二聚体；促凋亡蛋白Bax的BH3区域和具有抗凋亡作用的Bcl-2蛋白质表面的疏水槽结合，构成结构特异的异型二聚体[50]。研究发现，两种蛋白Bcl-2、Bax的表达通常是相对稳定的，而在细胞Bax表达过量时，Bax/Bax同源二聚体显著增多并增强细胞对死亡信号的敏感性，启动凋亡；当Bcl-2表达过多时，Bax/Bax二聚体大量分离，一个更加稳定的Bcl-2/Bax异源二聚体随之产生，抑制其诱导细胞发生凋亡，使细胞存活期延长[73]。因此，多种方法研究[74,75]后认为，Bcl-2和Bax两种因子的表达程度在细胞是否进入调亡途径的信号传导中发挥着及其重要的作用，Bcl-2和Bax的比值是决定细胞凋亡的检测的基本点[76]。当两者比例小于1，Bax起主导作用，诱导细胞色素C的释放，从而导致一系列级联反应的细胞凋亡发生。当二者比率≥1，Bcl-2起到的作用占优势，细胞色素C不再释放，线粒体途径的凋亡不起作用，细胞凋亡因此大大减少[77,78]。2.5.2Bcl-2、Bax蛋白表达能够作为Caspase-3的上游调控因素Bcl-2、Bax蛋白是致使线粒体膜发生通透性变化的紧要调节因素[79]，居于线粒体的上游，其能够通过过度表达来控制释放细胞色素C和激活caspase-3蛋白，进而介导细胞的存活或死亡[80]。在凋亡信号刺激下，Bax易位到线粒体膜，并在膜上形成了通透性很高的PT孔道，此孔道干扰并破坏了膜中的蛋白和离子的浓度梯度，致使细胞色素C和其他促凋亡因子的释放[81]。凋亡小体通过结合细胞色素C半胱氨酸蛋白酶结构域和Apaf-1而形成，并使procaspase-9在其上聚合[82]，进一步造成caspase-3活化，启动Caspase级联反应[83,84]。研究表明[68]，Bcl-2、Caspase-3两种因子间的抑制作用是互相的，Bcl-2能够抑制caspase-3的激活，而Bcl-2又能够作为激活后的caspase-3的底物[85]。Bcl-2过表达的蛋白结合Apaf-1并抑制其功能，防止caspase-9前体被激活从而实现抗凋亡作用；同时又可以和Bax构成异型聚合物，抑制Bax的易位和形成bax/bax二聚体，关闭PT通道，有效地阻断细胞色素C释放，抑制Caspase-3在下游的活化，从而起到了抑制细胞发生凋亡的作用[86]。Bcl-2蛋白在组织中的表达水平能够间接的反映出Caspase-3的活性[86]，反映了细胞凋亡的强度。此外，研究发现，Bcl-2的过度表达可导致核谷胱甘肽积累，导致在氧化还原动态平衡中核改变，防止细胞内钙离子流动，抑制线粒体膜细胞色素C释放，继而抑制caspase-3的活化，阻遏凋亡进程。-44- 第2章综述2.5.3Caspase-3亦能够作为bcl-2的上游调控因素Bcl-2能够作为caspase-3的直接反应底物之一，其环区在位于Asp34处被caspase-3所剪切，变成拥有促凋亡活性功能的裂解段，加速细胞凋亡过程，这一步是关键的凋亡信号转导步骤[86]。Kirsch[31]等人研究发现，凋亡提取物诱导的细胞凋亡明显可见bcl-2的剪切裂解片段，而对caspase-3进行免疫清除后的凋亡提取物诱导细胞凋亡时，得到了不被剪切的Bcl-2。当使用STAUrosporine（一种专一性抑制剂，癌基因抑制药）诱导Caspase-3不能表达的MCF-7细胞凋亡时，Bcl-2将不会被削减，因此我们可以说Caspase-3蛋白酶是Bcl-2的生理性的酶解蛋白酶，可以构成一个正反馈通路的细胞凋亡，即Caspase-3的活化能降低Bcl-2，使Bcl-2蛋白的表达量减少。2.6小结大量研究显示，特别是在线粒体凋亡途径中Bcl-2家族、Caspase家族在调控中起着非常重要的作用，然而，关于对caspase-3、Bcl-2、Bax三种因子的认识，有待进一步研究。当前，Bcl-2、Bax两种因子的激动剂和拮抗剂以及Caspase-3抑制剂，已经引起了人们的关注，这将有助于进一步阐明三者之间在细胞凋亡过程中的关系，揭示细胞凋亡的复杂的分子机制，并可能为凋亡相关疾病的治疗提供新的作用靶点，为设计出更有效的治疗手段提供重要的理论依据。参考文献[1]HossainMS,IfukuM,TakeS,etal.PlasmalogensrescueneuronalcelldeaththroughanactivationofAKTandERKsurvivalsignaling[J].PlosOne,2013,8(12):e83508.[2]AshkenaziA.Targetingdeathanddecoyreceptorsofthetumour-necrosisfactorsuperfamily[J].NatRevCancer,2002,2:420–430.[3]WangS,El-DeiryWS.TRAILandapoptosisinductionbyTNF-familydeathreceptors[J].Oncogene,2003,22:8628–8633.[4]WangX.Theexpandingroleofmitochondriainapoptosis[J].GenesDev,2001,15:2922–2933.[5]BachelorMA,BowdenGT.UltravioletA-inducedmodulationofBcl-XLbyp38MAPKinhumankeratinocytes:post-transcriptionalregulationthroughthe39-untranslatedregion[J].JBiolChem,2004,279:42658–42668.[6]DuanS,HajekP,LinC,etal.Mitochondrialoutermembranepermeabilitychangeandhypersensitivityto-45- 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