核干细胞因子在急性白血病的表达及其基因沉默对hl-60细胞的影响

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1、郑州人学2006年博士论文摘要核干细胞因子在急性白血病的表达及其基因沉默对HL一60细胞的影响博士研究生岳保红导师张钦宪教授郑州大学医学院组织胚胎学教研室郑州450052摘要核于细胞因子(nudeostemin，Ns)基因是Tsai和Mckav于2002年发现的一个与增殖调控相关的新基因，定位在3p21．1。它的产物Ns蛋白目前仅发现表达于干细胞和癌细胞的核或核仁中，能与p53结合，在已分化细胞中不存在。NS包括一个N末端的碱基、两个GTP结合结构域(GTP_bindingmotifs)、一个双螺旋区(coiled—coildomajn)和一个c末端的酸基，分子量为61KD。研究发现当细胞处于

2、早期多潜能状态时Ns蛋白呈高丰度表达，细胞开始分化时NS蛋白则在细胞退出细胞周期之前迅速下调至消失。Ns蛋白可能参与干细胞和癌细胞自我更新和无限增殖，并且使细胞保持在分化停滞状态。资料显示Ns蛋白可能是决定干细胞和癌细胞穿越G2／M检查点的特异性调控因子，是干细胞和癌细胞增殖所必须的蛋白质。急性白血病(acuteleukemia)是造血干细胞的恶性克隆性疾病，白血病细胞和正常造血干细胞有许多相似的特性包括自我更新的能力。已有的研究证实正常造血系统中，NS表达于带有c．Ht+／lin’标志的造血干细胞中，但在成熟粒细胞与淋巴细胞中不表达。白血病细胞是一群分化停滞、无限增殖的恶性克隆。目前，NS在

3、急性白血病细胞表达的研究还是空白，白血病细胞的无限增殖是否和NS蛋白相关，能否通过特异阻断Ns基因表达改变白血病细胞增殖方式还未见报道。RNA干扰(RNAi11te疵rcllce，RN舢)被认为是阻断特定基因、抑制相关蛋自表达的最有效手段。RNm是基因转录后沉默作用(post．t删q刚ptionalgenesilencing，PTGs)的重要机制之～。在体内外将siRNA导入真核细胞内可导致特郑州大学2006年博士论文摘要异性基因沉默。自从1998年被发现以来，作为有力工具，R№U技术已被用于胃癌、肝癌、宫颈癌、大肠癌、食管癌、卵巢癌等多种人类肿瘤的研究和探索性基因治疗。本研究应用RT_PcR

4、和免疫组化、w÷stemblot等技术检测急性白血病细胞中Ns基因是否表达及表达水平；体外合成Ns特异性短发夹状RNA(shonhairpjnRNA，shRNA)并转染人HL60白血病细胞，研究NS基因沉默对白血病细胞的分裂，增殖，分化，凋亡的影响；应用被NS。shRNA转染的人HL60白血病细胞接种于裸鼠体内，从组织学和细胞学水平检测转染和非转染HL60细胞致瘤能力差别；为了进一步证实其体内干扰效果，用Ns．shRNA体内治疗被HL60细胞致瘤的裸鼠，观察瘤组织体积、重量的变化并检测致瘤组织中HL60细胞内Ns蛋白表达以及细胞凋亡的变化。方法(1)用RT_PCR、免疫组化和westemblo

5、t的方法检测NS在HL-60和K562两种白血病细胞系以及急性白血病患者细胞中的表达。(2)应用T7启动子和T7RNA聚合酶体外合成两条NS．shRNA，比较阻断Ns-mRNA表达的效果，筛选一条作用强的Ns．shI冰A进行后续实验。(3)采用RT-PcR方法检测NS．shRNA在不同时间、不同浓度对HL60细胞Ns-mRNA表达的阻断效果。用免疫组化和wjstemblot方法测定Ns．shRNA转染后细胞内NS蛋白变化。(4)应用四甲基偶氮唑蓝(M丌)光吸收法和生长曲线检测和反映NS-shRNA转染对H【，60白血病细胞增殖作用的影响，用流式细胞仪(FCM)测定转染后细胞周期变化。(5)通过

6、流式细胞仪(FcM)测定Ns—shRNA转染前后HL60细胞表面分化抗原变化和酶化学法测定细胞内髓过氧化物酶(myelopemxjdaSe，MPO)、a一醋酸萘酚酯酶(a—n印hth01acetateesterase，a．NAE)来综合反映NS．shRNA．2转染对HL60细胞分化的影响。(6)通过FcM测定allnexinV结合率和TdT介导的duTP缺口末端标记(TUNEL)技术检测Ns—shRNA转染后HL60细胞的凋亡状况。(7)将Ns-shRNA转染24h后的HL60白血病细胞接种裸鼠前腿背侧，定Ⅱ郑州大学2006年博士论文摘要期观察移植成瘤情况，出瘤后每3d测量肿瘤大小一次，30d

7、后处死并称重剥离的瘤体重量，对瘤组织切片进行耻染色，观察瘤体组织结构，综合评价Ns基因沉默对HL60细胞致瘤能力的影响。制作高致瘤HL60细胞：将普通HL广60细胞致瘤的瘤组织剪碎，体外传代培养5代后再次按种裸鼠体内致瘤，可以增加出瘤率并使瘤体大小均一。将成瘤裸鼠分为对照组和治疗组2组，治疗组每3d通过腹腔内注射脂质体包裹的NS—slⅡⅢA一2一次，剂量为单g，对照组注射生理哉水。第13d处死全部