转化生长因子β1 基因对骨髓基质干细胞增殖分化的影响

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1、转化生长因子β1基因对骨髓基质干细胞增殖分化的影响【关键词】骨髓细胞关键词:转化生长因子β1;骨髓细胞;干细胞;转染摘要:目的观察转化生长因子β1（TGF-β1）基因能否转入骨髓基质干细胞（MSCs），并探讨经TGF-β1基因转染后的MSCs增殖和分化情况.方法取新西兰雄性大耳白兔的骨髓，得骨髓源MSCs体外培养.将重组TGF-β1和空载pcD-NA3基因分别转染MSCs后，免疫组化（SABC）法检测TGF-β1转染是否成功，用透射电镜和流式细胞仪观察两组MSCs的增殖和分化情况.结果SABC法证明TGF-β1瞬间转染成功;转染48h后，实验组MS

2、Cs增殖较对照组显著;实验组MSCs具有一定的分化趋势.结论重组TGF-β1基因转入骨髓源MSCs的方法是可行的，瞬间TGF-β1转染对MSCs的增殖和分化有显著促进作用.　　Keyinggroarrocells;transfection　　Abstract:AIMToinvestigateinggroesenchymalstemcells（MSCs）andifitcanbe，thentoob-servetheeffectofthesuccessfulrebinantTGF-β1genetransferonMSCs.METHODSAdultmale

3、Neultiplica-tionanddifferentiationofMSCsetryandtransilluminatingelectronmicroscopeandthe　positiveexpressionofTGF-β1munohis-tochemicalstaining（SABC）.RESULTSTransferultiplificationinMSCs-berincreasedobviouslyandthedifferentiationofMSCsissig-nificant.　　0引言　　转化生长因子β1（Transformingg

4、roo龄新西兰雄性大耳白兔1只，2.0kg（第四军医大学动物中心提供）;DEME培养液（Gibco）;胎牛血清（浙江金华清胡犊牛利用研究所）;胰蛋白酶（Sigma）;CO2培养箱（美国scien公司）;倒置显微镜（olympus）;淋巴（Ficoll）分离液（密度1.077）;TGF-β1免疫组化试剂盒（购自博士德公司）;流式细胞仪（FCM）检测细胞周期，透射电镜（TEM）观察.　　1.2方法　　1.2.1MSCs的分离培养将新西兰大耳白兔于耳缘iv250mLL-1乌拉坦2mLkg-1麻醉致死.无菌条件下取股骨骨髓;Ficoll分离液反复冲洗吹打，

5、20min，2000rmin-1离心两次，取中间乳白色的有核细胞层;用DEME培养液洗涤，并吹打成细胞悬液;接种于50mL培养瓶内，加入pH7.3的DEME培养基5mL.置入37℃，50mLL-1CO2孵育箱中孵育.　　1.2.2实验分组将第2代MSCs接种6孔培养板中的2孔内，孔内均预置盖玻片1片，并同时传代于6瓶50mL培养瓶中.当细胞生长至70%～80%融合时，按标准方法以3μLLipofectamine介导的1μLpcD-NA3-TGF-β1重组表达质粒转入3瓶细胞和1孔培养板中的MSCs，为实验组.其余均为对照组，仅转入1μLpcDNA3

6、空载体.　　1.2.3TGF-β1基因转染的瞬时表达48h后取出两孔细胞爬片，SABC法检测瞬时表达情况，各组用1瓶细胞在透射电镜下观察，其余两瓶细胞和培养板内细胞用流式细胞仪以488nm氩激光检测细胞周期.数据处理:实验数据以x±s表示，组间比较用t检验.　　2结果　　2.1TGF┐β1基因转染瞬间表达SABC法显示转染48h后，大部分TGF-β1基因转染细胞浆内充满棕色颗粒，pcDNA3空载体转染细胞对照组则为阴性（Fig1，2）.　　2.2TGF┐β1基因转染对MSCs增殖的影响试验组S期细胞DNA含量显著高于对照组，G0/G1期细胞DNA的

7、含量相对减少（Tab1）.　　表1转染后48hMSCs各细胞周期DNA含量比较　略　　2.3TGF┐β1基因转染对MSCs定向分化的影响TGF-β1基因转染MSCs功能活跃，粗面内质网增多、扩大，胞质内有丰富的核糖体、脂滴、线粒体和溶酶体及中等电子密度的无定形物，细胞核常染色质丰富，核仁清晰.空载体转染MSCs胞浆内亦有丰富的细胞器，但粗面内质网、核糖体明显少于实验组MSCs（Fig3，4）.　　图1－图4略　　3讨论　　许多组织中的间充质前体细胞的数量和增殖活性很高，具有向软骨分化的潜能.骨髓基质干细胞（MSCs）由于易于获取并能应用这些细胞在体

8、内修复弱骨缺损而引起研究者们极大兴趣.但体外培养时MSCs的分化机制较为复杂，不同细胞因子和培养条件对其的影响不同，而TG