2型糖尿病患者血清对人脐静脉内皮细胞骨架及胞浆内游离钙的影响论文

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1、2型糖尿病患者血清对人脐静脉内皮细胞骨架及胞浆内游离钙的影响论文周永红陈利国屈援颜亮唐海兰程少冰【摘要】目的探讨2型糖尿病患者血清干预人脐静脉内皮细胞(ECV304)对细胞骨架微丝及胞浆内游离钙浓度的影响。方法ECV304传代后取对数生长期细胞分为正常对照组(N组)、健康人血清干预组(H组)和糖尿病患者血清干预组(MD组)。按照1×105/ml将细胞种植在Petri皿中进行分组干预，其中健康人血清、糖尿病患者血清浓度分别占总体积的10%。采用Fluo3/AM作为荧光指示剂在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞内游离钙浓度的变化，采用荧光探针标记的

2、鬼笔环肽染色法观察细胞骨架微丝分布的差异。结果与N组比较MD组胞浆内荧光分布不均匀，胞浆内游离钙浓度显著升高，骨架微丝断裂，排列紊乱，少部分区域缺失。结论糖尿病患者血清干预正常的ECV304可以造成内皮细胞的骨架结构改变，主要与细胞内游离钙浓度升高有关。【关键词】2型糖尿病;血管内皮细胞;细胞骨架;胞浆内游离钙【Abstract】ObjectiveToexplorethemechanismsofECV304incubatedbytheserumofpatientsassociatedofhealthyperson)andMD(cultured

3、ofdiabetespatients)groups.Modelcells′intracellularfreecalcium(〔Ca2+〕i)andcytoskeletonicroscope(LSCM).Results①Thereconcentration(〔Ca2+〕i)ofECV304betofdiabetespatientscouldinjuryECV304andcausemodelcells’intracellularfreecalcium(〔Ca2+〕i)andcytoskeletonchange.【Keyellitus;Vascul

4、arendothelialcell;Cytoskeleton;Intracellularfreecalcium血管内皮细胞的完整性对于维持血管的正常功能有着重要的意义.freelmol/L，空腹血糖(8.25±0.97)mmol/L，OGTT2h血糖(12.68±1.44)mmol/L。随机选取健康志愿者30例作为正常对照组，男18例，女12例，平均年龄(23.7±3.4)岁。平均随机血糖(5.02±0.61)mmol/L，空腹血糖(3.81±0.40)mmol/L。1.2试剂与仪器Fluo3/AM和F127购自美国BioRad公司，罗丹明

5、标记的鬼笔环肽(Rhodaminephalloidin)购自美国Invitiogen公司，TritonX100和山羊血清封闭液(BSA)购自美国GIBCO公司，Hoechst购自华美生物工程公司。Phtri皿(美国Corning公司)，激光共聚焦显微镜(510METADUOSCAN，德国CARLZEISS公司)。人脐静脉内皮细胞株(ECV304)由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。1.3方法1.3.1血清制备空腹取血，自凝后4℃，2000r/min，离心15min。取上清液置无菌EP管中，56℃灭活30min，-20℃冻存，备用。1.3.2

6、细胞内游离钙浓度变化的观察按照1×105/ml将细胞种植在Petri皿中进行分组干预，组别为正常对照组(N组)，健康人血清干预组(H组)、糖尿病患者血清干预组(MD组)，其中健康人血清、糖尿病患者血清浓度分别占总体积的10%。终止干预后PBS缓慢冲洗2次，使用前将Fluo3/AM稀释至10μmol/L，加于培养的ECV304细胞样品上，37℃培养30min。取出Petri皿，用PBS冲洗5～10min，然后再冲洗1次，置于激光共聚焦显微镜下进行观察。Fluo3激发波长为488nm，发射波长为525nm，当Fluo3染色的细胞内钙离子浓度变

7、化时，荧光强度会发生变化，可记录到不同时间内细胞内钙离子浓度变化某一层面的荧光图像。Fluo3的钙离子解离常数(kd值)为0.37～2.3×10-6。以上实验重复6次。1.3.3细胞肌动蛋白微丝观察按照1×105/ml将细胞种植在6孔培养板上，培养板中预先放入洗涤干燥的盖玻片，进行分组干预，组别为N组、H组、MD组，其中健康人血清、糖尿病患者血清血清浓度分别占总体积的10%。终止干预后用37℃PBS洗细胞2次，用4%的多聚甲醛固定细胞，室温放置10～15min后，PBS清洗细胞2次。滴加0.1%TritonX100覆盖盖玻片，室温放置5min

8、后，PBS清洗细胞2次。抽提除骨架蛋白以外的其他蛋白，以便更清晰的显示微丝束。5%的山羊血清封闭液(BSA)孵育细胞30min，减少非特