2型糖尿病患者血清对人脐静脉内皮细胞骨架及胞浆内游离钙的影响

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1、2型糖尿病患者血清对人脐静脉内皮细胞骨架及胞浆内游离钙的影响作者：周永红陈利国屈援颜亮唐海兰程少冰【摘要】目的探讨2型糖尿病患者血清干预人脐静脉内皮细胞(ECV304)对细胞骨架微丝及胞浆内游离钙浓度的影响。方法ECV304传代后取对数生长期细胞分为正常对照组(N组)、健康人血清干预组(H组)和糖尿病患者血清干预组(MD组)。按照1×105/ml将细胞种植在Petri皿中进行分组干预，其中健康人血清、糖尿病患者血清浓度分别占总体积的10%。采用Fluo3/AM作为荧光指示剂在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞

2、内游离钙浓度的变化，采用荧光探针标记的鬼笔环肽染色法观察细胞骨架微丝分布的差异。结果与N组比较MD组胞浆内荧光分布不均匀，胞浆内游离钙浓度显著升高，骨架微丝断裂，排列紊乱，少部分区域缺失。结论糖尿病患者血清干预正常的ECV304可以造成内皮细胞的骨架结构改变，主要与细胞内游离钙浓度升高有关。【关键词】2型糖尿病;血管内皮细胞;细胞骨架;胞浆内游离钙　　【Abstract】ObjectiveToexplorethemechanismsofECV304incubatedbytheserumofpatientsa

3、ssociatedwithdiabetes.MethodsECV304wereobtainedbycultured9conventionallyanddividedintoN(control),H(culturedwiththeserumofhealthyperson)andMD(culturedwiththeserumofdiabetespatients)groups.Modelcells′intracellularfreecalcium(〔Ca2+〕i)andcytoskeletonwereassayed

4、bylaserscanningconfocalmicroscope(LSCM).Results①Therewasasignificantdifference(P<0.001)regardingtheintracellularcalciumconcentration(〔Ca2+〕i)ofECV304betweenMDandH,Ngroups.②Bythecytoskeleton,MDgroupwassignificantlydifferentwiththeGroupN.ConclusionsTheseru

5、mofdiabetespatientscouldinjuryECV304andcausemodelcells’intracellularfreecalcium(〔Ca2+〕i)andcytoskeletonchange.　　【Keywords】Type2diabetesmellitus;Vascularendothelialcell;Cytoskeleton;Intracellularfreecalcium　　血管内皮细胞的完整性对于维持血管的正常功能有着重要的意义，维持细胞正常的形态和完整性必须依赖细胞中存

6、在的细胞骨架〔1〕，而细胞骨架的分布变化又受到钙离子的调节。以往研究已经观察到利用患者血清可以造成血管内皮细胞损伤〔2〕，但其机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨糖尿病患者血清干预ECV9304后对于内皮细胞骨架结构的影响以及同细胞内钙离子浓度变化的关系，进一步阐明其致血管内皮细胞损伤的作用机制。　　1对象与方法　　1.1对象门诊及住院确诊的2型糖尿病患者40例，诊断均符合WHO(1999)和ADA(2005)2型糖尿病诊断标准。男21例，女19例，平均年龄(68.4±7.3)岁。平均随机血糖(13.25±1.3

7、7)mmol/L，空腹血糖(8.25±0.97)mmol/L，OGTT2h血糖(12.68±1.44)mmol/L。随机选取健康志愿者30例作为正常对照组，男18例，女12例，平均年龄(23.7±3.4)岁。平均随机血糖(5.02±0.61)mmol/L，空腹血糖(3.81±0.40)mmol/L。　　1.2试剂与仪器Fluo3/AM和F127购自美国BioRad公司，罗丹明标记的鬼笔环肽(Rhodaminephalloidin)购自美国Invitiogen公司，TritonX100和山羊血清封闭液(B

8、SA)购自美国GIBCO公司，Hoechst购自华美生物工程公司。Phtri皿(美国Corning公司)，激光共聚焦显微镜(510METADUOSCAN，德国CARLZEISS公司)。人脐静脉内皮细胞株(ECV304)由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。　　1.3方法9　　1.3.1血清制备空腹取血，自凝后4℃，2000r/min，离心15min。取上清液置无菌EP管中，56℃灭活