蚤休皂苷对氧化损伤脐静脉内皮细胞内钙离子变化的影响

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1、蚤休皂苷对氧化损伤脐静脉内皮细胞内钙离子变化的影响作者：高琳琳，李福荣，康莉，司艳红，王浩【摘要】　　目的利用激光共聚焦显微镜研究蚤休皂苷（Pa）对H2O2诱导的脐静脉内皮细胞（ECV304细胞）损伤的钙离子（Ca2+）的变化及其机制。方法体外培养ECV304细胞，建立氧化损伤的细胞模型，然后分为5个实验处理组：①正常对照组；②氧化损伤组；③高浓度蚤休皂苷（1μg/ml）组；④中浓度蚤休皂苷（100pg/ml）组；⑤低浓度蚤休皂苷（10pg/ml）组；应用激光共聚焦显微镜观察其细胞凋亡的形态学差异。并利用激光共聚焦显微镜观察、图像分析仪分析各实验分组细胞中游离Ca2+的表达、激光共聚焦显微镜

2、描记预处理前后Ca2+的动态表达。结果损伤组细胞内游离Ca2+浓度明显高于正常组(P<0.01)，而各蚤休皂苷预处理组均使Ca2+荧光强度下降，显著低于损伤组(P<0.01)，并呈剂量依赖性效应。H2O2损伤剂量的刺激下，ECV304胞浆内的游离Ca2+呈现双相变化：由静息状态持续增加到峰值，ΔF为37.22±3.72，平台期与静息状态荧光值的变化ΔP为7.65±0.69，加入蚤休皂苷预处理10min后，再加入100μmol/L的H2O2，ΔF和ΔP均明显下降(P<0.01)。结论蚤休皂苷可以保护H2O2造成的ECV304细胞的氧化损伤，与抑制了钙离子介导的凋亡通路有关，达

3、到保护内皮细胞、抗动脉粥样硬化的目的。【关键词】蚤休皂苷内皮细胞凋亡钙离子动脉粥样硬化　　Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectsandmechanismsofPariphyllin（Pa）oncalciumiondensityininjuryecv304inducedbyhydrogenperoxide.MethodsECV304cellsentalgroups:1.normal,2.oxidativedamagegroup,3.highdensityPariphyllin（1μg/ml）,4.mediumdensityPariphyllin（10

4、0pg/ml）and5.lol）.Laserconfocalmicroscopy(LCM)icchangeofthedensityofcalciumion(Ca2+).ResultsTheLCMshoagedgroup,theexternalCa2+concentationanner（P<0.01）.H2O2elicitedantransientpeakof［Ca2+］iandthenfelltoasubsequentsustainedhigherplateau.Pretreatmentl）for10minutesignificantlypreventedthetransientinc

5、reaseandsustainedtheincreaseof［Ca2+］i.ConclusionPariphyllinhasprotectiveactionagainstoxidativedamageofECV304inducedbyH2O2,itsmechanismmayberelatedtodecreasingthecellapoptosisandinhibitingcalciumion-decreasedmediatedsignaltransduction.　　Keyl，微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用；荧光探针Fluo-3/AM(MolecularProbesInc产品，美国)溶于

6、DMSO中，配成贮存液，放于-20℃冰箱保存；HEPES缓冲液(mmol/L)等试剂购于济南联星生物试剂公司。　　1.2仪器　　激光共聚焦显微镜：美国Bio-RadRadiance2100。　　2方法　　2.1细胞培养及干预将ECV304细胞在37℃，5%CO2条件下培养，以含10%FBS的RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/ml，按每瓶2ml接种于25ml的细胞培养瓶，每48h更换培养液1次。待细胞融合率为70%～80%时，无血清培养12h后使细胞同步化于G0期，然后按分组分别加药进行预处理24h，再加入氧化损伤药物H2O2，终浓度为100μmol/L，作用12h。细胞分组如

7、下：正常对照组:不加任何药物的培养基；氧化损伤组:H2O2终浓度为100μmol/L；蚤休皂苷高、中、低剂量预处理组:（1μg/ml，100pg/ml，10pg/ml），调整各组细胞浓度为5×10～5×106个/ml。　　2.2激光共聚焦显微镜观察各处理组细胞内游离Ca2+荧光强度的含量将ECV304制成105个/ml的细胞悬液接种于35mmPetri细胞培养皿中，实验分组加药同上，孵育24h后用HEPES缓