蚤休皂苷对氧化损伤脐静脉内皮细胞内钙离子变化的影响论文

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1、蚤休皂苷对氧化损伤脐静脉内皮细胞内钙离子变化的影响论文高琳琳，李福荣，康莉，司艳红，王浩【摘要】目的利用激光共聚焦显微镜研究蚤休皂苷（Pa）对H2O2诱导的脐静脉内皮细胞（ECV304细胞）损伤的钙离子（Ca2+）的变化及其机制。方法体外培养ECV304细胞，建立氧化损伤的细胞模型，然后分为5个实验处理组：①正常对照组；②氧化损伤组；③高浓度蚤休皂苷（1μg/ml）组；④中浓度蚤休皂苷（100pg/ml）组；⑤低浓度蚤休皂苷（10pg/ml）组；应用激光共聚焦显微镜观察其细胞凋亡的形态学差异。并利用激光

2、共聚焦显微镜观察、图像分析仪分析各实验分组细胞中游离Ca2+的表达、激光共聚焦显微镜描记预处理前后Ca2+的动态表达。结果损伤组细胞内游离Ca2+浓度明显高于正常组(P0.01)，而各蚤休皂苷预处理组均使Ca2+荧光强度下降.freelin后，再加入100μmol/L的H2O2，ΔF和ΔP均明显下降(P0.01)。结论蚤休皂苷可以保护H2O2造成的ECV304细胞的氧化损伤，与抑制了钙离子介导的凋亡通路有关，达到保护内皮细胞、抗动脉粥样硬化的目的。【关键词】蚤休皂苷内皮细胞凋亡钙离子动脉粥样硬化Abst

3、ract：ObjectiveToinvestigatetheeffectsandmechanismsofPariphyllin（Pa）oncalciumiondensityininjuryecv304inducedbyhydrogenperoxide.MethodsECV304cellsentalgroups:1.normal,2.oxidativedamagegroup,3.highdensityPariphyllin（1μg/ml）,4.mediumdensityPariphyllin（100pg/

4、ml）and5.lol）.Laserconfocalmicroscopy(LCM)icchangeofthedensityofcalciumion(Ca2+).ResultsTheLCMshoagedgroup,theexternalCa2+concentationanner（P0.01）.H2O2elicitedantransientpeakof［Ca2+］iandthenfelltoasubsequentsustainedhigherplateau.Pretreatmentl）for10minute

5、significantlypreventedthetransientincreaseandsustainedtheincreaseof［Ca2+］i.ConclusionPariphyllinhasprotectiveactionagainstoxidativedamageofECV304inducedbyH2O2,itsmechanismmayberelatedtodecreasingthecellapoptosisandinhibitingcalciumion-decreasedmediatedsi

6、gnaltransduction.Keyl，微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用；荧光探针Fluo-3/AM(MolecularProbesInc产品，美国)溶于DMSO中，配成贮存液，放于-20℃冰箱保存；HEPES缓冲液(mmol/L)等试剂购于济南联星生物试剂公司。1.2仪器激光共聚焦显微镜：美国Bio-RadRadiance2100。2方法2.1细胞培养及干预将ECV304细胞在37℃，5%CO2条件下培养，以含10%FBS的RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/ml，按每瓶2ml接种

7、于25ml的细胞培养瓶，每48h更换培养液1次。待细胞融合率为70%～80%时，无血清培养12h后使细胞同步化于G0期，然后按分组分别加药进行预处理24h，再加入氧化损伤药物H2O2，终浓度为100μmol/L，作用12h。细胞分组如下：正常对照组:不加任何药物的培养基；氧化损伤组:H2O2终浓度为100μmol/L；蚤休皂苷高、中、低剂量预处理组:（1μg/ml，100pg/ml，10pg/ml），调整各组细胞浓度为5×10～5×106个/ml。2.2激光共聚焦显微镜观察各处理组细胞内游离Ca2+荧光

8、强度的含量将ECV304制成105个/ml的细胞悬液接种于35mmPetri细胞培养皿中，实验分组加药同上，孵育24h后用HEPES缓冲液洗涤两遍，加入终浓度为10μmol/L的Fluo-3/AM37℃负载。40min后再用HEPES缓冲液洗涤2次，立即置于激光扫描共聚焦显微镜下观察，激发波长为488nm，发射波长为525nm。实验中选用512线光束扫描成像，图像分辨率为512×512像素，采集频率0.2～0.5Hz。使用SimplePCI