β葡聚糖对巨噬细胞增殖 胞内游离钙及camp浓度的影响

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1、β葡聚糖对巨噬细胞增殖胞内游离钙及cAMP浓度的影响【摘要】探讨β葡聚糖对RAW264.7细胞增生、胞内游离钙及cAMP浓度的影响。方法：中性红比色法检测细胞生长,酚试剂法检测细胞蛋白质合成,动态检测β葡聚糖对胞内游离钙和cAMP浓度的影响。结果：微量β葡聚糖可促进细胞生长及蛋白质合成;β葡聚糖作用后3～5min使胞内游离钙浓度升高,作用1min后使cAMP浓度升高,并保持较高水平。结论：胞内游离钙及cAMP是β葡聚糖对RAW264.7细胞作用过程中重要的信使分子。【关键词】β葡聚糖胞内游离钙环磷酸腺苷RAW264.7细胞系增殖［Abstract］Objective:To

2、exploretheeffectofβglucanonproliferation,intracellularcalciumandcAMPlevelsofRAW264.7macrophagecellline.Methods：Cellgrowthandproliferationweredetectedbyneutralredcolorimetricassay,proteinsynthesisbyLowry′stest,andtheconcentrationofcytosoliccalciumandcAMPweredeterminedcontinuously.Results：Cellgro

3、wthandproteinsynthesiswereenhancedbyβglucan;theconcentrationofcytosoliccalciumwaselevated3～5minaftertreatmentwithβglucancAMPlevelincreased1minafterthetreatmentandmaintainedathighlevel.Conclusion：7CytosoliccalciumandcAMPwereimportantsignalmoleculesinevaluatingeffectofβglucanonRAW264.7cellline.

4、［Keywords］βglucan;intracellularcalcium;cAMP;RAW264.7cellline;proliferation随着免疫抑制剂、激素、广谱抗生素的大量应用,器官移植技术的广泛开展、各种导管的广泛应用及肿瘤治疗的广泛应用,真菌感染尤其深部真菌性医院感染日益增多。β葡聚糖是真菌细胞壁含量最高的多糖。本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7为观察对象，观察不同浓度及不同时间的β葡聚糖对RAW264.7细胞的直接影响,特别是对细胞内第二信使传递的影响,以探讨β葡聚糖对RAW264.7细胞的作用机制。1材料与方法1.1试剂RPMI1640、胎牛血清购自Gi

5、bco公司；Fura2AM购自中国科学院药物所；β葡聚糖和EGTA购自Sigma公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯。1.2细胞培养7小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院。于37℃，5%CO2湿润环境中培养,每3天更换1次培养液,细胞生长汇合成单层细胞时及时传代,常规培养液为含10%胎牛血清的RPMI1640。1.3细胞生长曲线和蛋白质含量的测定取对数生长期的细胞按3×103个/孔接种于96孔板(Cellstar),共接种16板。待细胞贴壁后，吸出孔内的培养液和未贴壁的细胞。各给药组分别给予含12.5，25，50，100，200和400μg/mlβ葡聚糖

6、的培养液200μl，进行培养。每板上作对照,每个β葡聚糖浓度作3个平行孔。每天定时取上述培养板2块,于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,然后将其中1块板以中性红比色法［1］检测细胞生长情况,另1板用lowry法测定蛋白质含量［2］。以培养时间(d)为横坐标,中性红比色法测得的D值和蛋白质含量为纵坐标,分别绘制细胞生长曲线和蛋白质变化曲线。1.4胞内游离钙浓度测定　细胞内游离钙浓度的测定按文献［3］方法进行。1.5cAMP浓度测定　7于100ml培养瓶内接种RAW264.7细胞,待细胞生长接近汇合时给予不同浓度β葡聚糖刺激,分别于刺激后1，5和15min3个时间点取样。取样时弃培养液

7、,立即向瓶内加入1ml预冷的0.24mol/L高氯酸溶液,用橡皮刮收集细胞,冰浴下超声破碎细胞,离心取上清,以KOH中和至pH6.3左右,去除沉淀的高氯酸钾,取上清液冷冻干燥后于-20℃保存备用。cAMP浓度测定按试剂盒(上海中医药大学)说明书进行。1.6数据处理　实验结果用±s表示,以方差分析作统计学处理。2结果2.1β葡聚糖对RAW264.7细胞生长的影响在相差显微镜下观察,β葡聚糖对RAW264.7细胞形态无明显影响。对生长曲线和培养