冰片对大鼠血小板胞浆内游离钙离子浓度的影响

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1、冰片对大鼠血小板胞浆内游离钙离子浓度的影响【摘要】目的研究冰片对血小板内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)的影响，以探讨其抗血小板聚集作用的可能机制。方法采用双波长Fura-2荧光法测定血小板胞浆内游离钙离子浓度(［Ca2+］i)。结果在有无细胞外钙存在时，冰片血清均能够明显抑制5-HT诱导的血小板胞内［Ca2+］i升高（P<0.05）。结论冰片可抑制血小板聚集，其作用机制可能与其抑制血小板胞浆［Ca2+］i升高有关。【关键词】冰片；血小板聚集；钙；5-羟色胺ChinaAbstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectof

2、borneloncytoplasmicfreecalciumlevelinratplateletsanditspossiblemechanismofanti-plateletaggregation.MethodsPlatelet［Ca2+］iinedbydoublebeamfluorescencespectrophotometricmethod.ResultsS测定龙脑含量为56.20％，为合成冰片；Fura-2/AM由日本Dojindo公司提供，用二甲基亚砜（DMSO）溶解成1mmol/L，分装，-20℃避光保存；二甲基亚砜（DMSO）、羟乙基哌嗪乙磺酸

3、（Hepes）均为Amersco公司产品；牛血清白蛋白（BSA），由华美生物工程公司提供；Amresco公司产品；5-羟色胺硫酸肌酐，sigma公司产品，用0.1mol/LHCl溶液溶解后，用Tris-NaCl溶液调pH为7.4，分装，-70℃避光冻存；乙二醇双（2-氨基乙基）醚四乙酸（EGTA），MBCHEM公司产品，用新鲜配制的1mol/LNaOH配制成0.5mol/L的溶液（pH8.5）；TritonX-100，Amresco公司产品，用三蒸水配成20％的溶液；ACD溶液含柠檬酸钠89mmol/L、柠檬酸16mmol/L、葡萄糖243mmol/L；无

4、Ca2+的Hepes缓冲液含NaCl140mmol/L、KCl3mmol/L、MgSO41mmol/L、Hepes10mmol/L、葡萄糖10mmol/L，用1mol/LNaOH调pH7.40；血小板负载液含NaCl140mmol/L、KCl3mmol/L、MgSO41mmol/L、Hepes10mmol/L、葡萄糖10mmol/L，0.4%BSA，用1mol/LNaOH调pH7.40，使用前预先通氧饱和；其它均为国产分析纯，所有试剂均用新鲜制备的三蒸水配制。　　1.3仪器LS-55荧光分光光度计，美国Perkin-Elmer公司产品。　　2方法　　2.1

5、冰片含药血清的制备取雄性SD大鼠20只，随机分为冰片组和溶剂对照组，每组10只。冰片组灌服冰片粟米油溶液（1.5g·kg-1）15ml·kg-1，给药1次，药后30min，腹主动脉取血，400r/min离心15min，分离血清，56℃水浴30min灭活，得冰片血清，置-70℃冰箱保存备用。溶剂对照组给等容量的粟米油，按上述方法制备空白血清。应用气相色谱法测得冰片血清中含冰片12.16μg·mL-1。　　2.2水洗大鼠血小板悬液制备大鼠以10％水合氯醛35mg/kg体质量腹腔注射麻醉，腹主动脉穿刺取血8ml，用ACD溶液以1∶5（ACD∶血）的比例抗凝，在(

6、20±2)℃下76×g离心15min，吸取上层富含血小板血浆（PRP），再将PRP在(20±2)℃下以500×g离心5min，弃上清，得血小板沉淀，用无Ca2+的Hepes缓冲液洗1次，450×g离心5min，弃上清，用无Ca2+的Hepes缓冲液悬浮。台朌蓝排斥试验检查细胞活性，活细胞率>90%。　　2.3Fura-2/AM负载取1ml血小板悬液与1ml血小板负载液，5μmol/LFura-2/AM混匀，使得Fura-2/AM在血小板悬液中的终浓度为2.5μmol/L，37℃水浴避光孵育40min，立即离心，弃上清，沉淀以无Ca2+Hepes缓冲液

7、洗两次，再用无Ca2+Hepes缓冲液重新悬浮，调整血小板浓度为300～400×109个plt/L待测。　　2.4分组及给药负载后的血小板悬液分为3组，分别是空白血清组、冰片血清低浓度组、冰片血清高浓度组。各组均于测定前用相应的空白血清或冰片含药血清37℃孵育10min后，进行荧光测定。　　2.5荧光强度测定［1，2］取负载的血小板悬液37℃温孵5min，在PELS-55型荧光分光光度计上做荧光测定，固定发射波长为510nm，扫激发波长，如激发波长波峰由380nm移至340nm，则表明Fura-2/AM已负载酯解进入细胞内。采用FFA模块的改变波长的时间扫

8、描，激发波长分别固定在340nm、380nm，波宽5nm，发射波长