钙离子浓度对奶牛乳腺上皮细胞增殖及免疫的影响

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1、钙离子浓度对奶牛乳腺上皮细胞增殖及免疫的影响研究生：储怡然导师：赵国琦教授(扬州大学动物科学与技术学院，225009)摘要本试验采用组织块法分离培养奶牛乳腺上皮细胞，采用多种方法纯化细胞。并以细胞为试验模型，采用HPLC、MTT、FCM法检测BMEC在不同Ca2+浓度处理后，单层细胞通透性与细胞凋亡的情况；并研究了不同Ca2+浓度与LPS刺激后细胞因子mRNA、MAPK和NF．v．B蛋白的表达。试验一用组织块培养法获得大量奶牛的原代乳腺上皮细胞，联合运用刮除法、相差消化和相差贴壁法、单克隆法可获得纯化的、活力旺盛的乳腺上皮细胞，经形态学鉴定为上皮细胞。用

2、不同Ca2+浓度的培养基孵育细胞，通过HPLC法检测单层细胞通透性。结果表明：降低胞外Ca2+浓度对紧密连接具有破坏作用。试验二通过MTT法检测不同Ca2+浓度对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响。结果表明：各浓度处理组较对照组对细胞增殖均有抑制作用，浓度越低抑制作用越明显；处理细胞48h较24h和72h对细胞增殖的影响更明显。此外，采用FCM法检测不同Ca2+浓度在48h时对细胞凋亡的影响。结果表明：0．45mmol／L浓度组对细胞凋亡和细胞存活率影响最显著。说明降低胞外Ca2+浓度对细胞凋亡具有促进作用。试验三不同Ca2+浓度与LPS组合刺激奶牛乳腺上皮细胞

3、，采用相对实时荧光定量法检测IL．1B、IL．6和IFN的mRNA表达。结果表明：在不同Ca2+浓度与LPS刺激下，三种细胞因子的表达量有所提高，IL．1p与IFN较对照组变化显著，但IL．6变化不明显。此外，采用ELISA法在蛋白水平上检测24h时MAPK和NF．rd3蛋白的表达量。结果表明：两种蛋白的表达量均有升高的趋势，但MAPK蛋白变化不明显，NF．1(B蛋白表达量变化显著。说明Ca2+能促进乳房炎细胞模型中细胞因子、MAPK和NF—v．B蛋白的表达。关键词：奶牛乳腺上皮细胞；胞外Ca2+；紧密连接；细胞凋亡；脂多糖；细胞因子；促分裂素源活化蛋白

4、激酶；核转录因子EffectsofdifferentCa2+concentrationonDr⋯一andimmunityfBovineOIlleratlOnan11tyOOVlneMammaryDrIMEpithelialCellsPostgraduate：ChuYiranAdvisor：prof．ZhaoGuoqiCollegeofAnimalScienceandTechnology,Yang凼ouUniversity,225009AbstractThisstudyusedexplantculturemethodtoseparatebovinemamm

5、aryepithelialcells(BM匣C)，andadoptedmanymethodstopurifiedcells．HPLC，MTTandFCMtechniqueswereemployedtoexaminethepermeabilityofmonolayersandapoptosisofthesecellsstimulatedwithdifferentextracellularCa2+levels．MeantimeweconductedtoinvesgatetheefrectongeneandproteinexpressionofBM匣Cwith

6、differentextracellularCaz+levelsandLPS．Experiment1：AlargenumberofprimaryBMECcouldbegainedfromtissueculture，thenpurifiedcellswereobtainedbytwicedigestionandadherence，scrapingandsingle—cellclone．Thesecellswhichcouldbeshowedfrommorphologyobservationwasepithelialcells．Weselectedsuita

7、bleconcentrationofextracellularCaz+whichstimulatedbovinemammaryepithelialcell．UsingHPLCtechniquewegottheresultofpermeabilityofmonolayers．TheresultshowedthatreducingtheconcentrationofextracellularC矛+coulddestroyTJ．Experiment2：Thee行．ectofextracellularCaz+onproliferationofBMECwasmea

8、suredbyMTT．Theresultrevealedthatalltheco