PCR3未知DNA扩增讲课教案.ppt

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1、PCR3未知DNA扩增图8-8反向PCR原理示意图8.3.2利用接头的PCR这类方法的第一步通常都是将基因组DNA用限制性内切酶切割，然后将序列已知的接头片段连接到酶切片段两端，以提供PCR需要的另一端引物。根据已知序列设计的引物和根据接头序列设计的引物，可将已知序列侧翼的未知序列扩增出来。巢式PCR反应模式图图8-9利用3’末端修饰的接头扩增未知DNA片段接头一端为平末端，另一端为长长的5’突出末端，而且在3’凹端带有一个修饰氨基(-NH2)，修饰的末端在PCR扩增时不能作为引物启动DNA的合成。首先选择合适的酶切位点酶切总基因组，将人工合成的接头连接在酶切片段两端，然后再

2、做PCR扩增。PCR扩增的引物是根据接头的突出末端序列而设计的引物LP1和LP2，以及根据已知序列设计的引物SP1和SP2。8.3.3热不对称交错PCRTAIL-PCR:thermalasymmetricinterlacedPCR利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段利用特异引物和随机引物进行PCR一般有3种产物生成：①由特异性引物和简并引物扩增出的产物(I型产物）；②由同一特异性引物扩增出的产物（II型产物）；③由同一简并引物扩增出的产物（III型产物）。TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（specialprimer，简称sp

3、1，sp2，sp3，约20bp），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（arbitrarydegenerateprime，AD，约14bp）相组合，以基因组为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。TAIL-PCR共分3次反应。TAIL-PCR用特殊的热循环程序使PCR反应有利于Ⅰ型产物的扩增，而抑制Ⅲ型非特异性产物。其中使用较长的高退火温度的嵌套特异引物和较短的低退火温度的随机简并引物，它们的退火温度明显不同。通过控制退火温度可控制何种引物占优势，从而控制产物的扩增。首先进行5轮高严谨度的扩增，此时主要是特异性的引物起作

4、用，单向扩增目的单链DNA。然后进行一个低严谨度的PCR循环，随机简并引物起作用，此前线性扩增的目的DNA产物可变成双链。在随后的扩增中高严谨度和中严谨度循环交错进行，使目的序列扩增大大超过非特异产物，从而控制特异产物和非特异产物的生成比例（图8-10）。最后再使用一个嵌套特异性引物进行第二次TAIL-PCR，可以得到大量的特异性产物。图8-10TAIL-PCR工作流程图此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢