微生物的生长及外界因素的影响

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第七章微生物的生长及外界因素的影响 微生物的生长与环境条件的关系极为密切。只有当外界供给适当的营养物质，并满足微生物对各种物理、化学因子的要求之后，微生物才能正常生长。如果外界环境条件不适宜，则可以抑制微生物生长，甚至引起死亡。第七章微生物的生长及外界因素的影响 一、无菌技术用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染；第一节纯培养微生物群体的生长从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研究和利用微生物的第一步。 常用的器具：试管、瓶子、培养皿等1、微生物培养的常用器具及其灭菌 高温干热灭菌常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌 2、接种操作火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行 无菌操作：在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行 二、获得纯培养的方法微生物在自然界中不仅分布很广，而且都是混杂地生活在一起。像土壤就是微生物的大本营，哪怕是一粒砂或一克土中，常生长着多种细菌及其他微生物。要想研究或利用某一微生物，必须把混杂的微生物类群分离开来，以得到只含一种微生物的培养。纯培培养:微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称纯培培养。纯培养技术是进行微生物学研究的基础！ 纯培养的分离，是研究和利用微生物的第一步，是微生物工作中最重要的环节之一。最常用的方法稀释分离法(平板分离法)稀释平板分离法单细胞挑取法选择培养基分离法等平板划线法涂布平板法 三、微生物生长量的测定生长:微生物在适应条件下，不断地吸收营养物质，组成各种细胞物质，这种重量与体积迅速增加，就是微生物的生长。繁殖:当微生物的细胞生长到一定阶段，母细胞开始分裂，产生子细胞，个体大量增加，这就是繁殖发育:这个从生长到繁殖是由量变到质变的过程就是发育。在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。 各种微生物，由于有不同的形态和结构，发育过程中的生长，表现出的现象也不同。微生物的生长量可以根据菌体细胞数量，菌体体积或重量作直接测定，也可以用某种细胞物质的含量或某个代谢活动的强度作间接测定。 （一）细胞的数量测定1、细胞总数测定包括死活细胞测定，不详讲，留在实验课中详细讨论。方法计数器直接测定（血球计数板计数法）涂片染色法比浊法 2、活菌数测定测定具有繁殖能力的单细胞微生物数量。方法平板菌落计数；最大概率法(MPN)膜过滤法(浓缩法)当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。 （二）细胞生物量测定1、干重法取定容培养物，用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离出来，洗净、烘干、称重，求得培养物中的细胞的重量，作为生长量的指标。真菌生长量的测定常采用干重法，将培养液中的振荡培养物过滤，收集菌丝，洗净，或在洋菜平板培养基上培养的菌体经短时间高温待洋菜溶化后滤出菌丝。洗净的菌丝，烘干后，测干重。 2、蛋白质测定法细胞的含蛋白质量是比较稳定的，可以从蛋白质量的测定求出细胞物质量，或者以测定芳香氨基酸量求蛋白质量，可以测定含全氮量来求蛋白质量（蛋白质量=氮量x6.25）。 3、DNA测定法DNA与DABA—2HCl（即新鲜配制的20%W/W、3.5—二氨基苯甲酸—盐酸溶液）显示特殊的荧光反应定容培养物的菌体悬液，应用这种荧光反应强度，求得DNA含量，可以反映所含的细胞物质量。也可以根据DNA含量计算出细菌数量，每个细菌平均8.4×10-5ugDNA 三、细菌的生长曲线在纯培养条件下，微生物生长的一般规律是：开始缓慢，逐渐加快，到达最高阶段后，又逐步下降，直至衰老死亡；表现出一个曲线式的发展过程。生长曲线—单细胞微生物（指细菌），接种到适应的新鲜液体培养基中，定期的测定细胞数目，以培养时间为横座标，以细菌对数为纵座标，划出的曲线，称为生长曲线。生长曲线①延迟期适应期②对数生长期③稳定期（最高平衡期）④衰亡期三、细菌的生长曲线 （一）延迟期菌种初接入到新鲜的培养液中，并不立即生长繁殖，而需要通过自身生理机能的调节以逐步适应新鲜的环境，因而在这段时间，细胞数几乎不增加，群体的生长率接近于零，曲线平缓。滞留期的适应时间长短，因菌种和培养条件而有差异，自几分钟到几个小时不等。 （二）对数生长期是微生物细胞生理最活跃的时期，在这个时期，微生物细胞繁殖数目最多，所繁殖的时间也最短，细胞数目增加（2，4，6，8，16，32，64……），以2n增加的（注：n表示繁殖的次数）。但微生物不能以对数生长速度一直的繁殖下去，为什么呢？因为营养物质的不足，代谢物的积累和环境条件的变化（PH、氧化还原电位、温度等不适应微生物生长），因而生长繁殖速度缓慢降下来，而达到最高生长期。 （三）稳定期细胞分裂时间开始延长，曲线上升缓慢，以后部分细胞停止分裂，少数细胞开始死亡，使新细胞的增加和老细胞的死亡渐趋平衡。这一时期是细胞内外积累代谢产物的重要时期。如抗菌素就在这期产生，芽孢细菌在此时形成芽孢。 （四）衰亡期环境变得更不利于微生物生长，细胞的生活力继续衰退，细胞死亡率逐渐增高，活菌数迅速减少，曲线下降。通过对微生物生长曲线的分析，反映了一种微生物在一定生活环境中（试管、摇瓶、发酵罐）的生长繁殖和死亡的规律。它即可作为营养和环境因素影响的理论研究指标，亦可用做调节控制微生物的生长发育的依据，指导微生物生产实践。 第二节环境条件对微生物生长和代谢的影响微生物在新陈代谢过程中，需要有一定的环境条件，同时又受到环境条件的影响，其环境因素的影响很多，有:温度PH湿度等其影响的过程是错综复杂的，现分别加以讨论。 一、温度（一）微生物对温度的适应范围微生物对温度是敏感的，它对微生物的生长与生存影响是很大的，它对生活机体的影响表现在两个方面：（1）随着温度的升高，细胞中的生物化学反应速度加快，生长速度也加快；（2）机体的重要组成如蛋白质、核酸等物质，对温度较敏感，随着温度的增高可能使蛋白质、核酸遭受不可逆的破坏。 微生物可生长的温度范围较广，已知微生物可以在-12—90℃均可生长，但每种微生物只在一定的温度范围内生长良好，各种微生物有其最适生长温度最高生长温度最低生长温度只有在最适生长温度范围内，微生物生长繁殖的才最快。 根据微生物对温度适应范围不同，可将它们分成:高温性微生物中温性微生物低温性微生物三类。 1、高温性微生物高温性微生物的最适生长温度在45—55℃，它们常见于温泉、堆肥、厩肥以及其它腐烂的有机物中，堆肥发酵过程中温度常达60—70℃，象细菌中的芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌，产甲烷杆菌和高温性放线菌等都属于高温性微生物。分布于温泉中的细菌，有的可在近100℃的高温中生长，这些耐高温的微生物，常给罐头工业，发酵工业带来麻烦。 2、中温性微生物绝大多数微生物都属于这一类，它们最适温度在25—37℃，中温性微生物室温性微生物体温性微生物25—30℃，主要是腐生性微生物。37℃，它们主要是哺乳动物的寄生性微生物。 3、低温性微生物可以在较低温度条件下生长的微生物称之为低温性微生物。它们常见于寒带的冻土、海洋、湖泊、冷泉以及冷藏中，它们最适温度在10—15℃，向冷藏食品的变质就是这类微生物引起的。它们常可在零度以下12℃的环境中生长。见P-100。 各类微生物生长的温度范围温度适应微生物类型最低温度最适温度最高温度高温性30℃45——55℃60——70℃中温性5℃25——37℃45——50℃低温性0—-12℃10——15℃20——30℃ （二）温度对微生物的影响1、高温对微生物的影响超过最高温度微生物停止生长甚至死亡。这是因为高温能使蛋白质凝固变性，同时破坏了酶的活力。因而能杀死微生物，所以可利用提高温度来达到杀菌的目的。灭菌的方法很多，如:干热灭菌灭菌湿热灭菌常压灭菌高压灭菌巴斯德消毒煮沸消毒间歇灭菌常规高压灭菌连续加压灭菌火焰灼烧灭菌热空气灭菌 灭菌：是应用物理或化学的方法杀死物品上或环境中的所有微生物的细胞或芽孢。概念：一般可用高温、过滤或其它的物理、化学方法使器皿、培养基或溶器中的所有微生物的细胞及芽孢杀死或除去。消毒一是应用物理或化学的方法杀死物体上绝大部分微生物（特别是病原微生物）。物品经消毒处理后，虽然有少数微生物未被杀死，但已不致引起有害作用。 首先讲干热灭菌干热灭菌火焰灼烧灭菌热空气灭菌直接用火焰灼烧灭菌，对于接种环，接种针或其它用具可采用这种方法灭菌。利用热空气使物体升温，然后致物体上所带的微生物由于干热脱水而死亡。灭菌的对象为：玻璃器皿等用具的灭菌，对于带胶皮的物体，液体及固体培养基等不能用此法灭菌。灭菌设备：是在烘箱（干燥箱中）进行的，灭菌条件为：160℃2小时即可达到灭菌目的。 接着讲湿热灭菌湿热灭菌又分成:煮沸消毒法巴斯德消毒法常压蒸汽灭菌、（间歇灭菌）、常规高压灭菌、连续加压灭菌 1、高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌是实验室及生产中常采用的灭菌法，常压下水的沸点为100℃，在加压情况下可提供高于100℃的温度。另外蒸汽热穿透力强，可迅速引起蛋白质凝固，所以高压灭菌是湿热灭菌方法中效果最好的。高压蒸汽灭菌常在高压蒸汽锅中进行。它们是一个可密闭的锅子，有的具有夹层，夹层或锅中可充满饱和蒸汽，并可在一段时间内使之维持一定温度与压力。使用时要完全排出锅内的空气而代之以饱和蒸汽。如有空气混存，则锅内温度将低于同样压力下由纯饱和蒸汽产生的温度，因为纯蒸汽与其压力间有一定关系。高压蒸汽灭菌不是由于压力的作用，而是由于蒸汽的高温致死微生物。 灭菌的条件为：一般在15磅/平方时（1.05公斤/平方厘米）蒸汽压，121℃的温度下处理15—30分钟，可达到灭菌目的。灭菌的对象为：各种耐热物品的灭菌。如一般培养基、生理盐水等各种溶液、玻璃器皿、工作服等。灭菌所需要温度与时间取决于被灭菌物品的性质，体积与容器类型等，对于体积大、热传导性较差的物品，加热时间常延长。 2、连续加压灭菌（continuousautoclaving）135-150℃，5-15秒，工业上发酵培养基135-150℃，2-6秒，牛奶或其它液态食品 3、间歇灭菌法:灭菌的条件为：将待灭菌物品置阿诺氏灭菌器或蒸锅（蒸笼）内，常压下100℃处理15—30min以杀死其中微生物营养细胞，冷后，置于一定温度（28—37℃）下保温过夜，使其中还可能残留的芽孢发育成营养细胞，再以同样方法加热处理，如此反复三次，可杀灭所有芽孢及营养细胞，达到杀菌目的。是用流通蒸汽几次反复处理的灭菌方法。灭菌的对象为：一般只用于不耐热的药品，营养物，特殊培养基等灭菌。在缺乏高压蒸汽灭菌锅时亦可用于一般物品的灭菌。缺点：此法灭菌比较费时。 4、巴斯德消毒法：这是用较低的温度处理牛乳，酒类等饮料，杀死其中可能存在的病原菌如结核杆菌，伤寒杆菌等，而不损害营养与风味的消毒方法。如用63—66℃，30分钟或71℃，15分钟处理牛乳，然后迅速冷却，即可供饮用。致死温度：在一定的条件下和一定时间内，例如十分钟内杀死微生物的最低温度，称之为致死温度。致死时间：杀死全部微生物体所需要的最短时间，称之为致死时间。 2、低温对微生物影响当温度低于最低温度时，微生物的代谢活动降低，接近于停止状态，但仍能存活，一但遇到合适的生活环境就可以生长繁殖，故此可用低温保存菌种，把一些细菌、放线菌、酵母菌、霉菌接种到琼脂斜面培养基上，生长好后，就可以放到4—7℃的冰箱中保存。很多细菌与病毒可保存于-26—-70℃的冰冻条件下，所以人们可以利用冷藏法保存食品，以限制其中微生物的生长而防止腐败。 二、湿度微生物和其它生物一样，必须有水才能进行代谢活动以及生长和繁殖。微生物在干燥环境中将引起代谢活动的停止以致死亡。日常生活中常用、烘干、晒干和熏干的方法来保存食物。微生物细胞含水量在70—80%，因此它们需要生活在含水的培养基质中或潮湿的空气中。 供微生物生长的培养基质中的（溶液中）渗透压和水的可给性有密切关系，一般微生物适应于环境中渗透压在3—6个大气压，如果溶液中溶质浓度过高（高渗溶液），渗透压过大，这时环境中的水对微生物失去了可给性，甚至使细胞脱水，造成生理干燥，使原生质收缩引起质壁分离，细胞停止生命活动，象家庭中用盐渍泡菜和蜜饯就是利用加大溶液中渗透压来控制其中微生物的生长而防止腐败的。 三、氢离子浓度（PH）环境中的氢离子浓度对微生物活动有很大的影响。酸碱度通常以氢离子浓度的负对数，即PH值来表示。1、微生物对PH值的适应范围微生物在正常生长过程中，它们所需要的PH有一定的范围，在这个PH范围内又有很小的适应生长繁殖的PH区域，在这个区域内，微生物生长繁殖最好，因而称之为最适PH。 各种微生物的最适PH和PH范围微生物最适PH值PH范围细菌6.5—7.53.8—12放线菌7.5—8.05—10霉菌4.0—5.81.5—8.5酵母菌3.8—6.02.5—8.0从表可以看出，细菌和放线菌所需要的PH在中性偏碱，而霉菌和酵母菌所需要的PH在偏酸性。从表还可以看出，微生物对PH要求的范围是比较宽的。 2、PH对微生物的影响微生物的细胞对PH值的改变是很敏感的，当环境中的氢离子浓度如果超过了微生物适应范围时，就会降低或抑制这些微生物生命活动。氢离子浓度影响微生物生长主要有以下几个方面：（1）影响微生物细胞中原生质膜的电荷，因而影响了微生物对营养物质的吸收；同一种微生物由于培养液中的PH值不同，可能积累不同的代谢产物，在不同的发酵阶段，微生物对PH的要求也有差异，例如黑曲霉在PH2—3的环境中发酵蔗糖，产物以柠檬酸为主，只有少量的草酸，当PH改变接近于中性（PH7）时，则产生大量的草酸，而柠檬酸的产量很少，所以，在工业发酵上往往可利用调节环境的PH，来控制发酵产物。（2）影响微生物酶的活性；（3）影响微生物的代谢产物； 3、微生物的生长发育也影响环境的PH变化微生物在生长繁殖过程中，产生酸性或碱性物质，从而改变了环境中的PH值，例如，乳酸细菌分解糖，产生乳酸，酸化了基质；尿素细菌水解尿素产生氨，碱化了基质。所以在培养基中加入一些缓冲剂（CaCO3）或磷酸盐，从而使环境中PH变化不大。培养基中的有机物质如蛋白胨、氨基酸也都有一定缓冲能力。 （一）好气性与厌气性四、通气条件和氧化还原电位微生物生活环境的通气条件指它是否与空气接触以及接触的程度，最主要的是空气中的氧气，也涉及氮气、二氧化碳和氢气。对于严格好气性微生物，氧气是好气性微生物呼吸的最终电子受体。是不可缺少的生活条件。氧气对严格厌气性微生物有害，微好气性微生物只需要少量氧气。耐气性微生物的生活不需要氧气，但氧气的存在对它们没有毒害作用。 （二）氧化还原电位Eh值即氧化还原电位。能综合反映环境的氧化还原状况。除受通气状况或氧分压的影响外，Eh值还取决于培养基中氧化/还原物质和PH等其它环境因素。一般说，Eh值在+0.3V以上适应好气性微生物生长，-0.1V以下适宜厌气性微生物生长。不同微生物种类的临界Eh值不等。 五、光和射线除了光合微生物外，大多数微生物不需要光，但有些微生物虽然不是光合微生物，可是它们表现一定的趋光性。例如灵芝菌在散射光光照下，才能长成具有长柄的盾状或耳状子实体。太阳光除可见光线外，还有长光波的红外线和短光波的紫外线以及更短的电磁波包括X—射线和r—射线。它们都具有杀菌的作用，波长越短，杀菌作用越强。 （一）紫外线紫外线的波长范围在136nm—390nm，不同波长的紫外线，具有不同的杀菌力，250nm—280nm波长的杀菌力最强。作用原理：主要是细胞中的核酸（DNA）具有吸收紫外线的能力，使核酸中的碱基配对发生错误，从而影响了DNA的复制，轻则发生突变，重则造成死亡。 象人们一般把东西拿到太阳光下曝晒，用的就是阳光中具有紫外线，具备杀菌作用的原理。目前，紫外线以用做强杀菌剂，有的已制成了紫外线杀菌灯管，放在无菌室中进行杀菌而用。另外，紫外线在遗传育种领域中用来做为诱变剂，因紫外线能引起DNA中碱基排列次序发生变化，从而引起了基因突变，产生新种。 （二）X—射线和r—射线X—射线和γ—射线具有更短波长，也具有强的杀菌作用，作用的原理引起物质电离，如水的电离，使水形成H和OH的自由基；自由离子与溶液中经常存在的氧分子产生一些具有氧化性的过氧化物如H2O2（过氧化氢）等，而使细胞受到损伤甚至死亡。低剂量的X—射线和r—射线可作为诱变剂，而使遗传育种中，高剂量作为杀菌剂。 六、化学药物很多化学药物对微生物有杀菌作用和抑制生长作用。低剂量的化学药物对微生物起抑制或防腐作用，高剂量的化学药物对微生物起杀菌作用。化学药物杀菌剂种类很多，现分如下几大类进行讨论。 （一）重金属盐类有无机和有机的重金属盐类，如汞、银、铅、锌、铜等重金属元素的化合物都有很强的毒性杀菌作用很强。杀菌原理：主要使细胞中蛋白质凝固变性或与酶以及某些活性物质的活性基团结合，妨碍这些基团的正常作用，而起抑制细胞生长的作用。 （二）氧化剂过氧化氢（H2O2）、高锰酸钾（KMnO4）次氯化钙[Ca（OCl）Cl或Ca（OCl）2]以及齿素如游离的氯、溴、碘、氟和它们的化合物等，都是氧化剂。杀菌原理：是破坏原生质结构或氧化细胞结构中的一些活性基团而发生杀菌作用。 （三）还原剂硫酸亚铁（FeSO4）、甲醛（HCHO）都是常用的还原消毒剂，甲醛是气体，但能溶解于水中，因而市场售的一般都是30—40%的水溶液甲醛。杀菌原理：主要能与蛋白质的酰基或巯基起反应，引起蛋白质变性，而死亡。 （四）表面活性物质乙醇、甲酚、来苏尔、石碳酸（酚）、新洁尔灭、肥皂等都是表面活性洁净消毒剂。杀菌原理：①降底细胞的表面张力；②能使蛋白质变性和损伤胞壁以及质膜的作用；③是破坏细胞膜的渗透性。 （五）无机碱类和酸类氢氧化钾（KOH）、硫酸（H2SO4）、氢氧化钠（NaOH）物质，都能起杀菌作用。杀菌原理：引起细胞物质的水解和凝结，例如，1%HCl、1%NaOH起杀菌作用。 （六）毒性物质二氧化硫（SO2）、硫化氢（H2S）、一氧化碳（CO）和氰化物（HCN）。杀菌原理：对原生质中的一些活性基团或辅酶成分能发生专性结合，使其失活，降低代谢活动或使代谢不能进行，达到杀菌作用。 （七）染料结晶紫、碱性复红、孔雀绿等染料都有一定杀菌作用。杀菌原理：主要是染料中有发色团和助色团，能和原生质中的电荷结合，使蛋白质变性，而达到杀菌作用，低浓度可起到抑制微生物生长的作用。 各种环境的因素对于微生物的生长发育的影响，有一定的规律性，在各种因素的最低和最高限度之间，微生物才能进行生命的活动，在最适的程度时，微生物的活动能力最强。例如对于一种微生物不合适的PH值，可以因为温度提高而加强它的不利影响，环境中温度过高，不适宜于一种微生物生长时，可以增加一些合适的营养物质而使继续生长等。但是在许多因素综合的一定环境中，某一因素的改变往往可以发生主导的影响。 复习题1、何谓细菌的生长曲线？可分为哪几个时间？2、测定单细胞微生物数量的方法有哪几种？3、测定细胞物质量的方法有哪几种？4、根据微生物对温度适应范围的不同可把它们分成哪几种类型？5、微生物在生命活动中受哪些理化因子的影响？6、名词解释：（1）灭菌、（2）、消毒