《62dna片段的扩增——pcr技术》教案

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1、《6.2DNA片段的扩增——PCR技术》教案学习目标：1、明确PCR技术的原理。2、知道PCR技术的用途。3、理解PCR技术的基本操作步骤。学习重难点：理解PCR技术的基本操作步骤。教学过程：一、为何不需要解旋酶？DNA解旋酶能降低DNA双链解成单链的活化能，在解旋酶的催化作用下，FtlATP提供能量，在生物体内的温和条件下就能使DNA的双链解成单链。在没有酶的催化作用下，就必须由外界提供更多的能量才能使DNA分子活化，当在体外加热到90oC-95oC,DMA分子就由常态转化为活跃状态，双链则解成单链。所以PCR技术扩增目的基因不需要解旋酚。二、为什么加入的原料是dNTP（脱氧核昔酸三

2、磷酸），而不是四种脱氧核昔酸？同学们在学习DNA复制的时候，都掌握了DNA的复制需要四种脱氧核糖核营酸作为原料,而PCR技术扩增目的基因需要的原料却是d'TP（脱氧核甘酸三磷酸）。同学们都有这样的疑问：同样是DNA的复制二者所需要的原料为何会不同呢？事实上在DNA复制时直接参与合成DNA的是四种脱氧核昔酸三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）,在DNA聚合酶催化作用下,引物或者已合成的DNA链的3，—疑基对进入的脱氧核昔酸三磷酸Q—磷原子发生亲核攻击,从而形成3，,5'—磷酸二酯键并脱下焦磷酸（PPi）o形成磷酸二酯键所需要的能量来自a—与B—磷酸基之

3、、可高能磷酸键的裂解。

4、（摘于沈同、一镜岩主编的第二版《生物化学》下册P328）。而在生物体内脱氧核营酸在磷酸激酶的催化下接受ATP提供的磷酸基，逐步转化为脱氧核昔酸二磷酸、脱氧核昔酸三磷酸后再参与DNA的合成。所以二者并不矛盾，用dNTP作原料在体外利用PCR技术扩增目基因简化了操作过程。三、为什么没有加入ATP?DNA的体内复制需要ATP作为能量物质，而体外利用PCR扩增目的基因为何没加入ATP呢？因为体内DNA的复制过程屮，解旋酶将DNA双链解成单链、脱氧核昔酸Z间磷酸二酯键的形成需要ATP提供能量。而体外D7A的扩增不需要解旋酶的催化，是通过提高温度使双链解成单链，这一步不需要ATP提供能量；由问题二

5、可知形成磷酸二酯键所需要的能量来自a—与P—磷酸基之间高能磷酸键的裂解（在体内是脱氧核苜酸在磷酸激酶的催化下接受八TP提供的磷酸基转化为脱氧核苗酸三磷酸时，将ATP内高能磷酸键的能量转移到脱氧核苗酸三磷酸分子内）。所以体外PCR扩增H的基因不需加入ATP0四、延伸过程是否需要DNA连接酶？现行的一些相应配套习题关于PCR扩增目的基因是否需要DNA连接酶说法不一，本人查阅到体内DNA的复制是边解旋边复制，且是半不连续复制，DNA分子的两条链是反向平行的,一条链的走向为5'—3',另一条链为3'—5',而DNA聚合酶的合成方向都是5'—3',所以在3'—5,走向的模板链上能以5'—3'方向

6、连续合成，称为前导链，另一条5'—3'走向的模板链上随复制叉的移动，形成许多5,—3,方向的不连续片段（称为冈崎片段），在DNA连接酶的作用下连接成一条完整的D7A链，称为滞后链。PCR扩增的原理是DNA双链复制的原理，但过程却不同于体内复制过程，既不是边解旋边复制，也不是半不连续复制,是DNA双链全部解成单链后，引物与DNA单链相应序列互补结合，然后在DNA聚合酶作用下同时以5'—3'方向连续合成进行延伸，不存在前导链与滞后链的区别，自然也就不需要DNA连接酶了。五、引物的作用是什么？在学习过程屮学生问到这样的问题：必修课本DNA复制那一节并未介绍DNA的复制需要引物，而利用PCR扩

7、增目的基因的时候则需要引物，那加入引物有何作用呢？实际上DNA的复制都需要引物，在体内复制时，先rflRNA聚合酶在DNA的模板上合成一段RNA引物，再ftlDNA聚合酶从R7A3'端开始合成新的DNA链，高中阶段为便于学生理解DNA的复制就没有介绍这部分知识，体外复制当然也要加引物了。但PCR技术扩增目的基因进加入引物还有特殊的作用。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是

8、从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点,长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短--致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使