pcr技术在dna片段扩增的应用与意义

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1、PCR技术在DNA片段扩增的应用与意义王韵川北医学院法医学系摘要：1985年，Mullis等人发明了PCR技术，短短十余年间，这一技术得到迅速发展和应用，由扩增己知基因发展到扩增未知基因。本文旨在介绍利用PCR技术扩增未知序列DNA片段的最新进展及这些技术在基因克隆研究屮的应用。1985年，美国PE2cetUS公司人类遗传研宂室的Mullis等人发明了体外无限扩增核酸片段的聚合酶链式反应，即PCR技术。目前，PCR技术己在众多的研究领域得到广泛应用，如在基因克隆、基因定点突变、cDNA文库构建、基因测序、载

2、体构建以及人类基因组计划等方面发挥着重要作用。在今天的“基因大战”中，新基因的发现与克隆已成为研究的热点。而扩增未知序列的PCR技术格外引人注目，许多新方法应运而生，本文旨在介绍这方面的研宄进展。关键词：PCR;DN八片段扩增;作者简介：王韵，男，汉族，籍贯：四川南充，学历:学士，职称:实验师，研究方向:从事法医物证学的科研与实验教学。1PCR新技术研宄进展经典的PCR技术是以待扩增基因两端20bp左右的核苷酸序列为引物，在TaqDNA聚合酶的作用下，进行DNA的体外扩增。因此它是以己知基因序列为前提的，然

3、而在现今的棊因克隆屮常遇到棊因序列未知的情况。为此研宂者发展了一系列的扩增未知序列的PCR技术。现分述如下。2同端化PCR(UT2RCR),(UniformedterminalPCR)UT2PCR的基本原理是首先将两条变性的单链DNA的3'端加上同样的特殊引物接头，使其具有相同的末端序列，然后以DNA单链为模板，接头的主体部分为引物，进行PCR扩增得到目的DNA片段。其具体方法:将一条具有回文结构的特殊引物接头，加在待扩增的单链DNA片段3'端，然后以其为模板，以该引物接头的5'端主体部分为引物，合成它们的

4、互补链，再通过变性、复性，使新合成的两条链复性。并在DNA聚合酶作用下补平，产生两端都含冇所连接引物5'端同一主体序列的模板分子，然后再用该主体序列作引物进行PCR反应，即可使未知序列的基因片段得以扩增。3反向PCR(ReversePCR)基本原理用反向的互补引物来扩增两引物之外的DNA片段。首先用限制性内切酶切割靶DNA片段，并用连接酶，使酶切所得DNA片段自身环化，然后再用内切酶消化核心区，并以该内切酶切点两侧的DNA片段为引物进行PCR扩增，可将邻近已知序列旁侧的未知DNA片段扩增出来RACE是利用P

5、CR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA末端的方法，又称为锚定PCR（AnchoredPCR）和单边PCR（0nc2sidcdPCR）。一般有两种RACE策略，分别用于扩增3'或5'端。在5'RACE中，第一条cDNA单链是以与基因中己知序列互补的寡聚核苷酸片段为引物合成的。去掉RNA模板后，用脱氧核糖核苷末端转移酶或T4RNA连接酶在单链cDNA3'端添加一个锚定引物序列尾巴。然后就可以用与基因中己知序列和锚定序列尾巴互补的序列为引物，进行典型的PCR反应。在3'RACE中，首先用寡聚（dT）引

6、物/接头做引物进行反转荥。这一寡聚（dT）引物可与mRNA的多聚（A）尾巴复性。寡聚（dT）引物/接头同时还用来在随后的PCR反应中作为锚定引物。反应中的另一引物与基因中某一特定序列互补。4mRNA差别显示技术(mRNAdifferentialdis2playreversetranscription2PCR,DDRT2PCR)1992年，LiangP和PardelA首次提出并运用了mRNA差别显示技术来分离基因。其一般原理为:利用一系列寡核苷酸为引物，其中一种锚定于mRNA3'端poly（A）进行反转录，形

7、成mRNA:cDNA杂交分子。然后进行PCR扩增。扩增时在PCR反应溶液屮除加入前一种引物外，再加入另一短的随机引物，通过两组引物的随机组合，使细胞中大约15000种mRNA均有扩增的机会，并在序列胶上显示出清晰的电泳带，从中分离出目的DNA片段。利用真核细胞mRNA均含有ploy（A）5'末端的特点，把其中3'端引物设计成T12MN（M表示为除T以外的三种碱基，N表示四种碱基中的任意一种），所以共有12种组合，分别对总RNA进行反转录，理论上这12种组合刚好覆盖所有mRNA,而£L每一种组合均可有效地进行

8、反转录，反应结束时，应全部形成mRNA:cDNA柴交分子。mRNA反转录出cDNA后，向反应体系中加入另一个十聚核苷酸的随机引物，连同T引物,进行标记的PCR扩增，然后，通过序列胶分析即可将差异表达条带，即目的条带从中检出，然后再冋收DNA,并进行常规PCR扩增，即可得到进行进一步鉴定所需要的量。5代表性差示分析（RDA）代表性差示分析技术由LisitsynN等1993年提出，代表式差示分析技术充分发挥了PCR以