6.2 dna片段的扩增——prc技术

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1、6.2DNA片段的扩增——PRC技术62DNA片段的扩增——PR技术★6.2DNA片段的扩增——PRC技术62DNA片段的扩增——PR技术★6.2DNA片段的扩增——PRC技术62DNA片段的扩增——PR技术★6.2DNA片段的扩增——PRC技术62DNA片段的扩增——PR技术★6.2DNA片段的扩增——PRC技术62DNA片段的扩增——PR技术★6.2DNA片段的扩增——PRC技术62DNA片段的扩增——PR技术★6.2DNA片段的扩增——PRC技术62DNA片段的扩增——PR技术★6.2DNA片段的扩增——PRC技术62DNA片段的扩增——PR技术★6.2DNA片段的扩增—

2、—PRC技术62DNA片段的扩增——PR技术★6.2DNA片段的扩增——PRC技术62DNA片段的扩增——PR技术★6.2DNA片段的扩增——PRC技术62DNA片段的扩增——PR技术★题目标（一）知识与技能1、了解PR技术的基本操作2、理解PR的原理3、讨论PR的应用（二）过程与方法　　在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外DNA污染，严格控制温度等反应条（三）情感、态度与价值观通过对PR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神★题重点PR的原理和PR的基本操作★题难点　PR的原理★教学方法启发式教学★教学工具多媒体★教学过程（一）引入新

3、在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？今天我们研究学习DNA分子的扩增技术――PR技术。（二）进行新1．基础知识PR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：1．1细胞内DNA复制条分析：条组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶DNA聚合酶打开DNA双螺旋催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3’

4、端起点1．2细胞内DNA复制过程（1）DNA的反向平行结构：（结合教材图－6）核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）由核苷酸通过3,-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。DNA双螺旋结构的反向平行结构：（2）DNA的复制过程:解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。DNA聚合酶结合：子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起。后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接

5、起（半不连续合成。先导链，滞后链）子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“’→3’合成”。感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。1．3

6、DNA分子复制的人工控制解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。恢复螺旋：在0℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。反应场所：PR仪（自动温度周期性调节）。［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）4．PR的反应过程变性复性延伸变性：在9℃时DNA解旋复性：在0℃时引物与DNA单链结合延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）2．实验操作2．1PR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水2．2

7、实验操作步骤2．3按照PR反应体系配方配制反应液；（2）将PR反应体系0μL用微量移液器转移到微量离心管（0L）中；（3）将微量离心管放到PR仪中；（4）设置PR仪的工作参数。（）DNA在PR仪中大量扩增。2．4水浴法：将微型离心管依次在9℃、℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。3．实验注意事项3．1避免外DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。3．4混匀后离心处理，使反应液集中