第二节 dna片段的扩增——pcr技术

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1、第二节DNA片段的扩增——PCR技术第二节DNA片段的扩增——PR技术[标要求]1．理解PR的原理，讨论PR应用。2．尝试PR技术的基本操作。[知识梳理]一．背景知识1．细胞内DNA复制步骤：（1）在作用下解开DNA双链(2)在作用下，以DNA单链为模板，合成一段;（两条DNA模板链各需一个RNA引物）(3)以RNA引物为起点，在作用下，以为原料，按照碱基互补配对原则合成两条新链。2．聚合酶链式反应(PR)概念;。3．PR过程与细胞内DNA复制过程区别：（1）引物是人工合成的单链，２０－３０个脱氧核苷酸，而不是RNA。(2)解旋通过对反应的控制实现而不依靠。4．P

2、R过程：(1)将PR缓冲液、、一对引物、四种、DNA聚合酶、g2+等成分加入到特制的微量离心管中。(2)高温变性：。(3)低温复性：。(4)中温延伸：。二．实践案例1．PR实验虽然原理复杂，但操作十分简单，因为生物制剂公司已把PR缓冲液、DNA聚合酶、脱氧核苷酸贮备液等组分配成了PR试剂盒，实验人员仅需加入模板DNA及引物即可，所以快速、高效、灵活和易于操作是PR技术的突出优点。2．材料用具略3．活动程序(1)加入各种试剂，混合，离心10s，放入PR仪中。(2)扩增循环，在PR仪上设置好PR热循环程序：循环数高温变性低温复性中温延伸第一次9℃,in℃,1in72℃

3、,1in30次9℃,30s℃,30s72℃,1in最后一次&sh;&sh;————72℃,7in注：反应产物在4℃保存4．检测扩增效果（1）稀释样品10倍（2）以H2作对照，在波长260n处，将紫外分光光度计读数调到零。（3）加入到厚度为1的比色杯中，测定260n处的光吸收值（4）DNA浓度（μg/L）=（A260n/002）×稀释倍数三．探究活动PR实验虽然操作简单，但实验设备及药品价格较高，可以利用自己准备的简易材料，设计并进行PR技术的模拟实验操作。四．PR技术意义PR能，从而有效地解决了因为样品中DNA含量而难以对样品进行分析研究的难题，大大提高了对DNA

4、分子的分析和检测能力，被广泛应用于、基因序列分析、遗传病诊断，古生物学研究以及形侦破案、亲子鉴定等。五．小知识：1．DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(-H)末端称为’端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。但DNA合成的方向是从子链的’端向3’端延伸。2．引物是一段RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PR的引物长度通常为20—30个核苷酸。3．在80&rd;—100&rd;的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链

5、又会重新结合成双链。[复习指导]本节复习要注重细胞内DNA复制过程和体外DNA片段的扩增——PR技术的过程，运用DNA复制过程原理相同的方法，明确体外DNA片段的扩增——PR技术在基因克隆、基因序列分析、遗传病诊断，古生物学研究以及形侦破案、亲子鉴定等方面的地位和作用。如何在体外创设细胞内DNA复制的条是PR技术的关键，细胞内的各种条实际上是利用PR仪模拟的。PR仪原理复杂，操作简单。[典例解析]1PR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是（）①PR过程需要的引物是人工合成的DNA单链②PR过程不需要DNA聚合酶③PR过程中DNA的解旋不依靠解旋

6、酶，而是通过对反应温度的控制实现的④PR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制A．①②③④B．①②．①③D．②④[解析]PR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同。第一，PR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸。第二，PR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反映温度的控制实现的。[答案]。2．在PR扩增前，需要将下列哪些物质加入微量离心管中？（）①模板DNA②模板RNA③DNA解旋酶④耐高温的DNA聚合酶⑤引物⑥PR缓冲液⑦脱氧核苷酸贮备液⑧核苷酸贮备液A．①④⑤⑥⑦B．①③④⑤⑥

7、⑧．②③④⑤⑥⑦D．①④⑥⑦⑧[解析]进行PR过程前，将PR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合、g2+等成分加入到一种特制的微量离心管中。[答案]A