dna片段扩增及dna连接-pcr讲解

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1、一、PCR实验背景二、PCR基本原理三、PCR引物设计原则四、PCR反应注意事项五、常见问题与对策六、PCR的应用讲解内容第二次实验课、DNA片段扩增及DNA连接一．实验背景Thepolymerasechainreaction(PCR)isinventedbyK.Mullisin1985.ThistechniqueisusedtoamplifyaspecificsequenceofDNAinvitrobysimulatingthereplicationprocedureofnaturalDNAinvivo.

2、PCRenableustounlimitedlyamplifyDNAfragments.TheNobelPrizeinChemistry1993体外扩增特异DNA片段二．PCR基本原理3’5’3’5’PCR3’5’5’3’5’5’targetsequence在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。模板（DNA或cDNA）2l10PCRbuffer（含MgCl2）5ldNTPs(10mmol/L)1l5’引物(10mol/L)

3、1l3’引物(10mol/L)1l去离子水（补足反应体系）39lTaqDNApol.(2U/l)1l轻弹管底混合（用离心机甩一下）50l在一微量离心管中依次加入下列试剂：加入顺序不是随机的：DNA聚合酶一定要最后加入。PCR仪设定的反应条件：94oC45SDNA变性55oC45SDNA复性72oC1min产物链延伸25-30个循环后72oC10min一般地，基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行PCR：介绍：PCR仪如果上盖加热的PCR仪，可以直接放入仪器中进行PCR；如果下面

4、加热的PCR仪，加入2滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。PCR仪内发生的反应变性退火延伸551234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩

5、增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程P

6、CR的特点72℃第2轮结束PCR产物的积累规律反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率等因素。pre-denaturation95℃for5min;Denaturation:95℃for30~60sAnnealing:37~68℃for30~60sextension:72℃

7、for30s~2min72℃extensionfor10min30cycles反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension）PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的特异性，这取决于引物与模板的特异结合。PCR反应中有两条引物，即5′引物和3′引物。三、PCR引物的设计引物设计的基本原则引物的设计实例(＊)PCR引物设计的基本原则2.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。在NCBI上搜索该基因。通过序列同源性

8、比较软件（比如DNAman）比对（Alignment），相同的序列就是其保守区。1.引物的方向永远是5→3引物长度一般在15~30核苷酸之间。引物长度（primerlength）常用的是18-27bp。过短会使PCR的特异性降低；过长没有必要。引物3′端要避开密码子的第3位。因为密码子的第3位易发生不改变aa突变。3.引物3’端是DNA延伸的起点，因此一定要严格与模板DNA配对。尤其是引物3′末端连续8个碱基