dna片段扩增及dna连接-pcr讲解

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一、PCR实验背景二、PCR基本原理三、PCR引物设计原则四、PCR反应注意事项五、常见问题与对策六、PCR的应用讲解内容第二次实验课、DNA片段扩增及DNA连接 一．实验背景Thepolymerasechainreaction(PCR)isinventedbyK.Mullisin1985.ThistechniqueisusedtoamplifyaspecificsequenceofDNAinvitrobysimulatingthereplicationprocedureofnaturalDNAinvivo.PCRenableustounlimitedlyamplifyDNAfragments.TheNobelPrizeinChemistry1993体外扩增特异DNA片段 二．PCR基本原理3’5’3’5’PCR3’5’5’3’5’5’targetsequence在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。 模板（DNA或cDNA）2l10PCRbuffer（含MgCl2）5ldNTPs(10mmol/L)1l5’引物(10mol/L)1l3’引物(10mol/L)1l去离子水（补足反应体系）39lTaqDNApol.(2U/l)1l轻弹管底混合（用离心机甩一下）50l在一微量离心管中依次加入下列试剂：加入顺序不是随机的：DNA聚合酶一定要最后加入。 PCR仪设定的反应条件：94oC45SDNA变性55oC45SDNA复性72oC1min产物链延伸25-30个循环后72oC10min一般地，基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行PCR： 介绍：PCR仪如果上盖加热的PCR仪，可以直接放入仪器中进行PCR；如果下面加热的PCR仪，加入2滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。 PCR仪内发生的反应变性退火延伸55 1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍 PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃ PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物 PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶 PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始 PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束 PCR产物的积累规律反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率等因素。 pre-denaturation95℃for5min;Denaturation:95℃for30~60sAnnealing:37~68℃for30~60sextension:72℃for30s~2min72℃extensionfor10min30cycles反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension） PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的特异性，这取决于引物与模板的特异结合。PCR反应中有两条引物，即5′引物和3′引物。三、PCR引物的设计引物设计的基本原则引物的设计实例(＊) PCR引物设计的基本原则2.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。在NCBI上搜索该基因。通过序列同源性比较软件（比如DNAman）比对（Alignment），相同的序列就是其保守区。1.引物的方向永远是5→3引物长度一般在15~30核苷酸之间。引物长度（primerlength）常用的是18-27bp。过短会使PCR的特异性降低；过长没有必要。引物3′端要避开密码子的第3位。因为密码子的第3位易发生不改变aa突变。 3.引物3’端是DNA延伸的起点，因此一定要严格与模板DNA配对。尤其是引物3′末端连续8个碱基要求与模板严格互补。但引物的3′端最好没有连续3个G和C。否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物3′端最好选择T？引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异。当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。引物3′端的从结合的角度讲最佳碱基选择是G和C。 4.碱基要随机分布。引物中四种碱基的分布最好是随机的，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。5.引物GC含量在45-55%(40%~60%)之间，Tm值最好接近72℃。上下游引物的GC含量不能相差太大。具有相似的Tm值。引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃。Tm值最好接近72℃。退火温度：一般低于Tm值2~10℃。引物长度要确保Tm值不低于54°C。 6.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物内部不应存在互补序列。以避免折叠成发夹结构(Hairpin)。尤其在引物3’末端。按经验，不能有连续4(5)个碱基的互补。引物3’末端一般不达到3bp。引物间不应存在互补序列。尤其应避免3’端的互补，以免形成引物二聚体。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol） PrimersThatFormHairpins•Aprimermaybeself-complementaryandbeabletofoldintoahairpin.•The3´endoftheprimerisbase-paired,preventingitannealingtothetargetDNA.5´-GTTGACTTGATAT3´-GAACTCT PrimersThatFormDimers•Primerpairsshouldbecheckedforcomplementarityatthe3'-end.Thisoftenleadstoprimer-dimerformationwithitselforwiththeotherprimer.•Primerdimerscanbeanexcellent,butunwanted,substratefortheTaqpolymerase.5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´ 7.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。引物5′端修饰包括：加酶切位点；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子。引入启动子序列等。标记生物素、荧光、地高辛等；引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。 8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）9.扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。10.引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。与模板之间的特异性结合序列一般不少于15-18bp。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。 引物设计1、GC比值：碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR退火温度的重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半。2、引物特异序列的长度至少为15-18bp。3、引物的方向：引物的方向永远是5‘→3’方向，正向（Sense）引物是与一股模板DNA序列相一致的，而反向（Antisense）引物则与这股模板DNA序列相互补。4、引物的酶切位点：通常在引物的5‘-端设计适当的限制性酶切位点。两种酶切位点使克隆具有方向性。5、引物上启始和终止密码：如果想表达DNA片段，所用的载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在引物的酶切位点之后、特异性DNA序列之前。6、如果表达的蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。 specificity:conservedgenomicregion.<75%homologouswithotherregion.Specially,8basesat3’end.(2)specificsequencelength:15/18～30base.(3)G+Ccontents＝45-55%.ATCGrandomdistributed(4)Avoidhairpinineachprimer,speciallyat3’end.(5)Avoidcomplementbetweenprimers(4bp以上）,speciallyat3’end.(6)uniquerestrictionenzymesitescanonlybeaddedtothe5’endoftheprimers.(7)Tisthebestcandidateat3’end？小结:引物设计时应遵循的原则(＊)GeneralrulesforPrimerdesign 引物的设计实例(＊)已知IFN-cDNA序列,你该如何设计引物？atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggctgttactgccaggacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagctgactaattattcggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcaaggtcgaagagcatcccagtaa atgaaatatacaagtgaagagcatcccagtaaatgaaatatacaagt3’5’3’5’上游(5’)引物的结合CTTCTCGTAGGGTCATT下游(3’)引物的结合设计引物时:5′引物与位于待扩增片段5′上游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成;3′引物与扩增片段3′端的一小段DNA序列互补，引导互补链的合成。PCR反应扩增的就是这一对引物之间的DNA片段。答：5’引物照抄，3’引物互补倒读；酶切位点加在引物的5’；调GC含量的碱机放在最前边；此外无发夹结构、与基因组其它区域的同源性较差。 atgaaatatacaagtgaagagcatcccagtaaatgaaatatacaagt3’5’3’5’上游(5’)引物的结合CTTCTCGTAGGGTCATT下游(3’)引物的结合----:ForG+CcontentSenseprimer:5’－GCAGCGGATCCATGAAATATACAAGT－3’15bpGC=11AT=15Anti-Senseprimer:5’－ATCGGAATTCTTACTGGGATGCTCTTC－3’17bpBamHIstartcodonGC=12AT=15EcoRIstopcodon引物的方向是5→3：特异性序列是否少了点? 通常在引物的5‘-端设计适当的限制性酶切位点 引物设计软件介绍：PrimerPremier5.0顾名思义，该软件就是用来进行引物设计的。可以简单地通过手动拖动鼠标以扩增出相应片段所需的引物，而在手动的任何时候，下面显示各种参数的改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等。也可以给定条件，让软件自动搜索引物，并将引物分析结果显示出来。而且进行这些操作非常简单Oligo6.57引物分析著名软件，主要应用于核酸序列引物分析设计软件，同时计算核酸序列的杂交温度（Tm）和理论预测序列二级结构。PrimerD'Signer1.1免费的引物设计辅助软件，专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引物设计工作。 四．PCR反应注意事项OptimizationofPCRcondition＊PCR方法操作简便，但影响因素颇多。 去离子水（补足反应体系）39l模板2l10PCRbuffer（含MgCl2）5ldNTPs(10mmol/L)1l5’引物(sense10mol/L)0.5~1l3’引物(anti-sense10mol/L)0.5~1lTaqDNApol.(2U/l)1l轻弹管底混合（用离心机甩一下）（一）、PCR反应体系-----finalvolume50l加各种成分最好在冰上进行。 1.模板DNA不是越多越好：2l1)在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高，2)但模板浓度过高会导致引物无法与模板结合，反应的非特异性增加。3)一般采用102105拷贝的待扩增片段作为模板:微克水平的基因组DNA、重组质粒DNA用ng水平的量。4)模板过多还能大量消耗镁离子。Theamountoftemplate—“moreisless”.Don’taddtoomuchtemplate TemplateDNA不能含有其提取时所用试剂：提取genomicDNA的基本过程：（1）裂解细胞，消化蛋白质，抑制DNaseactivityproteinaseK＋SDS＋EDTA（2）然后用酚－氯仿多次抽提，去除蛋白质（3）用RNase去除RNA（4）用乙醇沉淀DNA，airdry,无菌水溶解。 2.引物：0.5lPrimer1:OD=5PCR反应引物浓度为0.1~0.5μmol/L,引物与模板的摩尔比至少为108：1。如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。但引物浓度太高，（1）会增大引物结合到不严格配对区域的机会，这样的错配会导致非特异性产物的扩增;（2）可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该比例太低，PCR效率也会降低。primers 引物的配制Primer1:OD=5注意：冻干品，计算一管引物的总含量或克分子数先配成100mM的浓度作为储存液工作液:10mol/L,-20℃保存。50l反应体系中加：0.5～1l,终浓度：0.1~0.5mol/L如果需要反复应用的引物，配制后一定要分装保存，一段时间后弃掉。切记：不要将合成回来的引物一次性配成工作液！primers RT的引物选择：Oligo(dT)15-18Specificanti-senseprimerRandomprimer因为基因序列与mRNA序列是一致的。病毒RNA作为RT模板时，一定要知道病毒是属于哪一种病毒：正链RNA病毒？负链RNA病毒？正链RNA病毒：RT引物用anti-senseprimer；负链RNA病毒：RT引物用senseprimer。 ThermostableDNApolymerase3.DNA聚合酶活性：5`--3`方向的聚合酶活性。在75~80℃具有最高的聚合酶活性。半衰期：95℃，40分钟缺乏3`--5`外切酶活性。因此没有校正功能。Fidelity（保真度）：PCR反应的错配率一般为1~2X10-4AnextraA（3.1）TaqDNA聚合酶(2U/l)1l 保存:在-20℃至少6个月。抑制剂:乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS等。内源DNA污染:制备过程中残留的原细菌DNA等。会在无模板对照管出现扩增带。在50μl反应体系中加Taq:一般为0.5~2U，TooLowConc.:lowactivity，PCR产物的量减少TooHighConc.:non-specificamplification.加各种成分最好在冰上进行。操作时先加水，最后加酶 （3.2）PfuDNA聚合酶此酶耐热性极好，在97.5℃半衰期>3小时，具有35外切酶活性，催化DNA合成的忠实性比TaqDNA聚合酶高12倍。3→5proofreadingexonucleaseactivity.withgreateraccuracy.noextraA. （3.3）Vent-TMDNA聚合酶半衰期：100℃，95分钟97.5℃，130分钟其扩增产物的长度可达10~13kb。活性：具有35外切酶活性，具有校对功能，错误掺入率为1/31000。忠实性比TaqDNA聚合酶提高510倍。 （3.4）TthDNA聚合酶半衰期：950C，20分钟活性：具有逆转录酶活性，可简化RT-PCR。但不具35外切酶活性，没有校对功能，催化聚合反应的错误掺入率为1/500。 缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。4、10XPCRbuffer5lBuffer:10-50mmol/LTris-HCl(pH8.3-8.8,20℃)。 5、Mg2+：20~25mmol/L3lForTaqpolymeraseactivity.镁离子浓度：1.5~2.0mmol/LConcentration:tooLow:lowactivitytooHigh:non-specificamplificationTaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。 当反应体系中含有高浓度的primers、dNTP、EDTA时:•上述分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响TaqDNA聚合酶的活性。•Vary[Mg2+]instepsof0.5mMWithin1.5~5.0mM;•Sometimesacompromisebetweenyieldandspecificity. dNTPs贮备液：浓度为10mmol/L。（注：dNTP具有较强的酸性，使用时应用1mol/LNaOH将pH值调至中性(7.0~7.5)。分装，－20℃存放，反复冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTPs浓度在20~200μmol/L。dNTP浓度过高会增加非特异性配对碱机的错误掺入率。低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，减少PCR产物量，但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP浓度应相同:错误碱基的掺入率降至最低。1kbgene:1l;2kbgene:2l6、底物:dNTPs（脱氧核苷三磷酸）(10mmol/L)1l（被稀释了50倍,即浓度：200mol/L） 7、添加剂：DMSO（二甲基亚砜）2.5l相当于将退火温度提高了5℃。但>10％的DMSO会对聚合酶活性产生不良影响。加入适量二甲基亚砜（终浓度：5％）有利于引物、模板的解链，减少其二级结构， 1）为什么有时候需要进行热启动？（二）、如何确定PCR的变性、退火和延伸温度和时间？热启动：TaqDNA聚合酶在DNA双链充分打开之后再加入PCR反应体系中，这样可保证模板DNA、引物变性充分，避免发夹结构或其它二级结构影响引物的退火，使引物能更加顺利地、特异性地结合到模板上。热启动结束后暂停PCR反应，在PCR仪上直接趁热加入DNApol。OptimizingthePCRReactionprogram 变性温度：一般选用94～95℃。变性时间：可根据模板长短、G和C含量确定，一般采用30秒。2）变性但过高或时间过长都会导致酶活性损失。HalflifeofTaqDNApolymerase：92.5oC2h，95oC40mins，97oC5mins.30cycleswillneed15min 3）退火温度和时间PCR的基本流程：94oC,45sec55oC,1min72oC,2min退火温度的变化是根据引物的GC比例、引物的长度调整的。AnnealingFrom45oCto60oC.Usuallyitisaround55℃for1min.退火温度与引物序列关系非常密切，退火时间与引物长度和GC含量有关。引物长度一般在15-25bp之间。Tm=4(G+C)+2(A+T) (a)AnnealingtemperatureistoohighPrimersandtemplatesremaindissociated.(b)Annealingtemperatureistoolow.Mismatchedhybrid.(c)Correctannealingtemperature.Primingoccuresonlyatthedesiredtargetsites.Howtodecideannealingtemperature?(a)(b)(c)温度越高，特异性(specificity)越高。 温度：72℃，74℃，是Taq酶的最适工作温度。时间：根据待扩增基因片段的大小确定延伸时间。过长会导致产物非特异性增加。酶的延伸效率：1000bp/1min。小于500bp，一般采用1分钟即可；500~2000bp:2min。超过2000bp，一般可适当延长延伸时间，3分钟。4）延伸温度和时间 典型的PCR条件：94～95℃30S，55℃1min，72℃2min25～30个cycles后72℃延伸10min。循环次数：25～30cycles循环过多会增加碱基的错配几率。4）循环次数 总结：其他因素1）热启动：提高扩增的特异性2）添加剂：DMSO消除引物与模板的二级结构，降低DNA的解链温度，增进DNA复性时的特异配对。3）液体石蜡：防止反应液蒸发后反应成分的改变。HowbigisatargetDNA?•typicallyinthesizerange100-1500bp.•Longertargetsareamplifiable—>25kb.•Requiresmodifiedreactionbuffer,cocktailsofpolymerases,andlongerextensiontimes. 五、常见问题与对策 PCR常见问题之一无扩增产物---假阴性1.模板:①提取的模板核酸中含有杂蛋白质、酚、EDTA等抑制了Taq酶活性②toomuchortoolittle原因 2.引物：①选一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，两引物带的亮度应大体一致，如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物发生降解:引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放4℃导致引物变质降解失效。④引物设计不当:引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量,甚至不出扩增条带。酶失活：①酶的失活，②PCR时忘了加Taq酶。变性不彻底：变性温度低，变性时间短。退火温度太高，延伸时间太短PCR仪温度的准确性。设立阳性对照假阴性 PCR常见问题之二假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物 PCR污染原因实验室中克隆质粒的污染、PCR扩增产物污染实验室中加样枪、白大衣、PCR试剂的污染实验室中气溶胶污染标本间交叉污染PCR污染：极微量的污染便可导致假阳性 打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出，防止将靶序列溅出离心管外，防止将靶序列吸入加样枪内，造成实验室污染；除了酶等不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。手套、离心管及枪头(质量好）等一次性使用,不要碰到别处。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。3)各种试剂先进行分装，低温贮存。防止污染的方法 合理分隔实验室隔离的专用操作区、专用加样器①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区. 阴性对照试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染设立适当的对照标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照 PCR常见问题之三非特异性扩增现象：1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致；2）或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 1)引物特异性差,引物与靶序列不完全互补、或形成引物二聚体。其对策:必要时，重新设计引物。2)模板或引物浓度过高3)酶量过多或质量不好4)Mg2+浓度偏高5)退火温度偏低6)循环次数过多原因非特异性扩增 PCR常见问题之四拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态M12 1)模板不纯或降解2)Buffer不合适3)退火温度偏低4)酶量过多或质量差5)dNTP、Mg2+浓度偏高6)循环次数过多原因拖尾如果是在低分子量部分有smear,可能是引物dimer,应当减少引物量，或更换引物。如果是在高分子量部分有smear,可能是高分子的DNA模板，应减少模板量，或减少循环数。 六、PCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断肿瘤各种肿瘤检测人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析其他……