《DNA提取和pcr扩增》PPT课件

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1、实验三：DNA提取及PCR反应蒋建伟第一部分：DNA提取一、DNA提取的基本步骤三、DNA提取常见问题与对策二、DNA提取注意事项一、DNA提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中DNA提取（一）样品准备：1、组织：3g组织，用8层纱布包好，再包多层牛皮纸，浸入液氮，取出，用木锤敲碎。碎组织放入搪瓷钵中，加少量液氮，碾磨至粉末状。在50ml离心管中，加10mlDNA提取液，用玻棒边搅动液体，边加入组织粉末，37℃混匀。2、组织，3g，-70℃保存，临用时用玻璃匀浆器，用DNA提取液将

2、组织磨成匀浆。注：DNA提取液见p-8或p-11,下同。（一）样品准备3、培养细胞消化收集细胞，PBS洗3次，加10mlDNA提取液，混匀。4、血液取血液离心，取淡黄色白细胞层，加NS，离心。或者加D2.H2O，离心，收集白细胞。加10mlDNA提取液，37℃mix。（一）样品准备（二）提DNA酚抽提法：加RNase，37℃1h，加蛋白酶K，50℃，3h；或37℃12h,不时mix加等体积酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。加等体积酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。氯仿-异戊醇(24:1)抽提1次。9000rpm，3min，小

3、心吸取上层粘稠水相。移到50ml烧杯中，加2.5倍体积冷无水乙醇，用玻棒钩出DNA。TE溶解。2、异丙醇沉淀法：原理：用2倍体积异丙醇沉淀DNA溶液，DNA沉淀是丝状，而RNA溶于异丙醇中，可除去RNA。细胞，PBS洗2次。3mlTEN重悬，加DNA提取液，蛋白酶K，50℃1～4h加等体积饱和酚，混匀，9000rpm3min，小心吸取上层粘稠水相。氯仿-异戊醇(24:1)抽提1次，9000rpm3min，小心吸取上层粘稠水相。加2倍体积的异丙醇，用玻棒钩出DNA。TE溶解。（二）提DNASDS法-提取DNASDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析

4、，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%SDS法DNA提取缓冲液小结SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－SDS法CTAB法CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与

5、核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，可通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。举例CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl

6、提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA－CTAB法CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA－CTAB法CTAB法流程图：植物材料裂

7、解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液二、DNA提取注意事项1.材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取注意事项2.细胞裂解适量。过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细