最新PCR3未知DNA扩增教学讲义PPT课件.ppt

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1、PCR3未知DNA扩增8.3.1反向PCR反向PCR（inversePCR）是一种简单的扩增已知序列周边未知序列的方法，其扩增原理见图8-8。首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段。根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA片段扩增出来。图8-9利用3’末端修饰的接头扩增未知DNA片段接头一端为平末端，另一端为长长的5’突出末端，而且在3’凹端带有一个修饰氨基(-NH2)，修饰的末端在PCR扩增时不能作

2、为引物启动DNA的合成。首先选择合适的酶切位点酶切总基因组，将人工合成的接头连接在酶切片段两端，然后再做PCR扩增。PCR扩增的引物是根据接头的突出末端序列而设计的引物LP1和LP2，以及根据已知序列设计的引物SP1和SP2。8.3.3热不对称交错PCRTAIL-PCR:thermalasymmetricinterlacedPCR利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段利用特异引物和随机引物进行PCR一般有3种产物生成：①由特异性引物和简并引物扩增出的产物(I型产物）；②由同一特异性引物扩增出的产

3、物（II型产物）；③由同一简并引物扩增出的产物（III型产物）。TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（specialprimer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（arbitrarydegenerateprime，AD，约14bp）相组合，以基因组为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。TAIL-PCR共分3次反应。TAIL-PCR用特殊的热循环程序使PCR

4、反应有利于Ⅰ型产物的扩增，而抑制Ⅲ型非特异性产物。其中使用较长的高退火温度的嵌套特异引物和较短的低退火温度的随机简并引物，它们的退火温度明显不同。通过控制退火温度可控制何种引物占优势，从而控制产物的扩增。首先进行5轮高严谨度的扩增，此时主要是特异性的引物起作用，单向扩增目的单链DNA。然后进行一个低严谨度的PCR循环，随机简并引物起作用，此前线性扩增的目的DNA产物可变成双链。在随后的扩增中高严谨度和中严谨度循环交错进行，使目的序列扩增大大超过非特异产物，从而控制特异产物和非特异产物的生成比例（图8

5、-10）。最后再使用一个嵌套特异性引物进行第二次TAIL-PCR，可以得到大量的特异性产物。图8-10TAIL-PCR工作流程图致命性胸痛的识别与紧急处理病例特点胸痛、胸闷、憋喘、双肺湿啰音。粉红色泡沫样痰（入院后）。高血压病史多年急诊抢救室—目的快速识别和处理致命性胸痛常见致命性胸痛心脏：ACS、急性心肌炎、急性心包炎、急性心包压塞大血管：主动脉夹层、肺栓塞呼吸系统：张力性气胸消化系统：自发性食管破裂急性心源性胸痛1、病史、症状、体征2、心电图的动态演变3、血清心肌损伤标记物浓度的动态改变4、超声

6、心动图5、冠脉造影主动脉夹层1、诱因：剧烈活动、剧咳、血压骤升后。2、性质：前胸或背部撕裂样持续性痛，可向腹、颈、臂等部位放射。3、脑缺血表现：头晕、意识障碍、肌肉瘫痪、视力障碍、大小便障碍等。4、心脏表现：心脏压塞、心梗、主动脉瓣漏5、压迫表现：双侧血压、脉搏不对称，腹胀、腹泻、黑便，血尿、少尿，声带麻痹等。主动脉夹层—辅检1、胸片：纵膈增宽2、超声心动图3、主动脉CTA急性肺栓塞1、高危因素：下肢深静脉血栓、长期卧床、手术、外伤、慢性心扉疾病。2、胸痛性质：胸膜性刺痛，为定位明确的刀割样锐痛，吸

7、气时加重。3、伴随症状：呼吸困难、咯血、低血压、休克、急性右心衰、猝死。4、体征：下肢浅静脉曲张、局部肿胀、压痛，心率频数、P2＞A2，呼吸急促，颈静脉充盈，血氧饱和度低。急性肺栓塞—辅检1、心电图：SⅠQⅢTⅢ，T波倒置，ST段压低等。2、D二聚体升高。3、动脉血气分析：低氧血症、低碳酸血症。4、肺动脉CTA。5、其他。自发性张力性气胸1、诱因：剧烈咳嗽、活动、提重物等。2、疼痛性质：尖锐刺痛、撕裂样痛、向同侧肩、对侧胸部或腹部放射。3、伴随症状：呼吸困难、发绀、休克、昏迷4、体征：患侧胸部饱满，

8、呼吸动度弱，叩诊鼓音，气管向健侧移位，呼吸音低。5、胸片即可确诊。自发性食管破裂1、病因：饱食或饮酒后剧烈呕吐史，或外伤史。2、症状：剧烈呕吐，胸骨后痛，可向两季肋部、下胸、肩胛部放射，严重者有呼吸困难、甚至休克。3、体征：皮下气肿、液气胸、胸膜炎、急腹症。4、胸片：纵膈气肿、液气胸。5、食管造影：泛影葡胺、碘油。6、胸腔壁式引流：可见胃液、食物残渣。需要的辅助检查—总结1、心电图、心电监护2、动脉血气分析3、血常规4、床边胸片5、心肌损伤标记物、D二聚体6、超声心动