最新多聚酶链式反应扩增DNA片段教学讲义PPT课件.ppt

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1、多聚酶链式反应扩增DNA片段温故知新1:组成DNA分子的基本单位是什么?这些基本单位是如何连接成DNA分子的?DNA分子结构有什么特点?脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤(A)鸟嘌呤(G)胞嘧啶(C)胸腺嘧啶(T)5’5’3’3’DNA分子的复制过程是怎样的?DNA分子的复制需要哪些条件?温故知新2DNA母链:提供复制的模板解旋酶:打开DNA双链4种脱氧核苷酸:合成子链的原料DNA聚合酶:催化合成DNA子链ATP:为复制过程提供能量引物:使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(一小

2、段RNA)DNA复制的条件1、PCR(多聚酶链式反应)技术:是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。2、原理:利用了DNA的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合。一、基础知识(一)PCR原理:DNA母链:提供复制的模板解旋酶:打开DNA双链4种脱氧核苷酸:合成子链的原料DNA聚合酶:催化合成DNA子链ATP:为复制过程提供能量引物:使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(一小段RNA)3、PCR反应的条件80—100℃:耐热的D

3、NA聚合酶:缓冲溶液:维持反应的pH值不变(一般是一小段单链DNA)(二)PCR反应的过程1、变性:温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚成为单链。2、复性(退火):温度下降到50℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。3、延伸:温度上升到72℃左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。PCR循环第一步:加热变性:双链DNA解聚成为单链模板序列模板序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步:引物与模板序列复性(退火):引物

4、与模板DNA单链的互补序列配对结合模板序列模板序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步:引物延伸:合成新的DNA链模板序列模板序列第1个PCR循环完成后:得到两个拷贝的靶序列循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,82430次循环后扩增的数量4、PCR循环的结果②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。①从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,并且由引物Ⅰ延伸而成的D

5、NA单链会与引物Ⅱ结合,进行DNA的延伸。第一轮结果12341234第二轮结果二、实验操作1、PCR仪(一)设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器。2、微量离心管一种薄壁塑料管,总容积为0.5ml。3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体,其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。PCR仪微量离心管微量移液器1、准备2、移液(二)实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂①过程:盖严微量离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管壁。

6、②注意:3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁,目的是使反应液混合均匀。A、离心管口的盖子一定盖严,防止实验中脱落或液体外溢。将离心管放入PCR仪上,设置好PCR仪的循环程序。①过程:将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4、离心5、反应②离心目的:使反应液体集中在离心管底部,提高反应效果。循环数变性复性延伸预变性94℃,5min--30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1minPCR技术高度灵敏,为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验,P

7、CR操作时要注意做到:6、注意事项①隔离操作区,所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌;②分装试剂,简化操作程序,使用一次性枪头,一次性吸液枪头用一次更换一次。(一)理论上DNA扩增数目的计算三、课题成果评价1、一条DNA,复制n次,DNA为:2n2、a条DNA,复制n次,DNA为:a2n(二)实验中DNA含量的测定1、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果,DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DNA的含量有关。2、过程①稀释2uLPCR反应液,加入98u

8、L蒸馏水,即将样品进行50倍稀释。②对照调零以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的读数调节至零。取DNA稀释液100uL至比色杯中,测定260nm处的光吸收值。③计算④计算DNA含量(g)=50x(260nm的读数)x稀释倍数公式中50的含义:50g/ml的DNA在标准厚度为1cm比色杯中的吸光值为1。比色杯四、课题延伸例如:PCR产物每轮循环增加一倍,30轮循环扩增量达230个拷贝(1

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