多聚酶链式反应扩增dna片段

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1、多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR技术)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段脱氧核糖含氮碱基磷酸AGCT1、DNA的基本单位－脱氧核苷酸一、DNA分子的结构12345O鸟嘌呤脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸2、脱氧核苷酸的种类A腺嘌呤脱氧核苷酸GCTATGCAGCT3、DNA分子的平面结构氢键5'端3'端5'端3'端4、DNA的立体结构——双螺旋结构2、时间：细胞分裂间期（有丝分裂间期，减数第一次分裂的间期）1

2、、概念：以亲代DNA为模板，根据碱基互补配对合成子代在DNA的过程。3、场所：主要是细胞核（其次是线粒体、叶绿体）二．细胞内DNA复制的过程4、条件：①模板：亲代DNA的两条母链②原料：游离的四种脱氧核苷酸③能量：ATP④酶：解旋酶、DNA聚合酶⑤引物：一小段RNA，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对5、过程（1）解旋：解旋酶、ATP（2）以DNA的两条母链为模板，根据碱基互补配对规则，合成子链。（3）子链、母链螺旋构成子代DNADNA体内复制（示意）6、复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。7、DNA复制的方向DNA的合

3、成方向总是从子链的5’端向3’端延伸条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶TaqDNA聚合酶不需要催化合成DNA子链能量ATP不需要引物一般是一小段DNA使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸1、PCR的技术（DNA体外复制）的条件DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）一、PCR的原理（PCR的技术原理）一、PCR的原理（PCR的技术原理）1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸高温变性低温复性重复1~3步30轮3、DNA复制的方向

4、DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸2、步骤：变性——复性——延伸PCR技术的原理总结利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。体外DNA复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。复制的方向：子链的5’端向3’端延伸。二、PCR的反应过程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次复制第一次复制555555模板DNA5555

5、555525～30次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。每个循环包括：变性——复性——延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。PCR的反应过程总结三、PCR反应的实验操作1、PCR仪设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更

6、换一次实质上一台能够自动调控温度的仪器三、PCR反应的实验操作（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）循环数变性复性延伸第一次94°C,10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min四、结果分析与评价DNA含量的测定：稀释→对照调零→测定→计算（公式

7、见P63）波长260nm处读数蒸馏水做对照50倍（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关2、过程①稀释2µLPCR反应液，加入98µL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100µL至比色杯中，测定260nm处

8、的光吸收值③测定并计算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1,DNA的含量为50g/ml的体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制PCR技术解旋在解旋酶作用下，细胞提