多聚酶链式反应扩增dna片段

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1、课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段教材内容解读要点1　多聚酶链式反应多聚酶链式反应是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。要点2　PCR原理（1）在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似．细胞内参与DNA复制的各种成分和基本条件以及各自的作用如下表：参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能

2、够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（2）DNA的方向通常将DNA的羟基(－OH)末端称为3’端，面磷酸基团的末端称为5’端。（3）引物引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。引物的作用：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3'端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。（4）DNA的合成方向当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3’端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5’

3、端向3’端延伸。（5）DNA的变性与复性在80-100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。（6）PCR对DNA双链的解聚与结合控制PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。（7）TaqDNA聚合酶的应用PCR中的高温会导致普通DNA聚合酶失活，而耐高温的TaqDNA聚合酶解决了这个问题，大大增加了PCR的效率，使PCR技术趋向自动化。（8）PCR扩增DNA的基

4、本条件PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供：DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物。四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。要点3　PCR的反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。要点4　实验操作做PCR

5、通常使用微量离心管，它是一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL。具体操作时，用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分，再设计好PCR仪的循环程序就可以了。如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为94℃、55℃和72℃，然后按照上表的要求，在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管即可。PCR的突出优点是快速、高效、灵活和易于操作。要点5　DNA含量的测定DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰(见下图)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。具体步骤如下：（1）将样品进行

6、50倍稀释：取2LPCR反应液，加入98L蒸馏水。（2）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。（3）加入步骤1中的DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。（4）计算DNA含量。公式：DNA含量(g)=50×（260nm的读数）×稀释倍数。要点6　实验注意事项（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸气灭菌。（2）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪

7、头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心臂放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。