多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

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1、课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段一、PCR的原理问题：（1）原理是什么？（2）原料是什么？（3）条件是什么？模板、酶、引物参赛选手：***3’端和5’端：DNA的羟基的末端称为3’端，磷酸基团的末端称为5’端聚合酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)KaryB.MullisPCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。利用PCR技术扩增耐高温的DNA聚合酶第一篇报道分离耐高温DNA聚合酶的论文的作者是台湾的年

2、轻科学家--钱嘉韵。1973年，钱嘉韵到俄亥俄州的辛辛那提大学生物系就读。她的指导老师崔拉对一种在黄石公园的热泉里发现的嗜热菌感到好奇，就让钱及另一位美国学生以该细菌为论文研究的主题。在另一位老师的指导下，钱嘉韵学会了从细胞中分离蛋白质，并成功分离出该细菌耐高温的TaqDNA聚合酶。反应体系模板耐热的DNA聚合酶dNTP：dATP、dGTP、dCTP、dTTP引物缓冲液Mg2+ATP分子结构特点（具有高能磷酸键）ATP---三磷酸腺苷ATP的结构核糖PPP~~腺嘌呤腺苷A—腺苷T—三个（Tri）P—磷酸基团～—高能磷酸

3、键高能磷酸键三磷酸腺苷与腺嘌呤核苷酸的区别：AMPP核糖腺嘌呤ATP分子结构特点（具有高能磷酸键）ATP---三磷酸腺苷ATP的结构核糖PPP~~腺嘌呤腺苷A—腺苷T—三个（Tri）P—磷酸基团～—高能磷酸键高能磷酸键脱氧腺嘌呤核苷酸的区别：dAMPP脱氧核糖腺嘌呤A—P~P~P腺苷磷酸基团高能磷酸键ATP是各种活细胞内的一种高能磷酸化合物.30.54KJ/mol第二个高能磷酸键相当脆弱，水解时容易断裂，释放出大量的能量ATP的结构简式：DNA的基本单位－－核苷酸脱氧核苷酸核糖核苷酸dNMPdAMPdGMPdCMPdT

4、MPNMPAMPGMPCMPUMP3’端和5’端：DNA的羟基的末端称为3’端，磷酸基团的末端称为5’端5’5’3’3’5’3’5’3’DNA聚合酶DNA连接酶DNA复制的条件：模板DNA、脱氧核苷酸、解旋酶、引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶引物利用PCR技术扩增①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、_______________、___________(做启动子)、___________

5、.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增二。PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引

6、物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链细胞内复制.VS.PCR扩增DNA母链4种dNTPTaqDNA聚合酶引物（2个snDNA）温度控制1）模板：2）原料：3）酶：DNA母链4种dNTP解旋酶DNA聚合酶引物酶DNA连接酶DNA增殖4）特点:半保留复制边解旋边复制(不用DNA连接酶)半保留复制全解旋再复制5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/A—G引物Ⅰ5/3/G—G引物ⅡPCR原理变性复性延伸PCR反应过程可分为三步：变性、复性（退火）、延伸1．变性双链模板DN

7、A解离为单链结构。（90～95℃）DNA双链DNA单链变性2．退火（复性）引物与模板互补成双链。（40～60℃）(由于引物浓度高，序列短，所以易与模板结合。)PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸引物PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸3．延伸在Taq酶作用下，合成特异DNA序列。70～75℃延伸变性第二次循环退火第二次循环延伸第二次循环①②③④25次PCR扩增过程动画DNA片段的PCR扩增步骤：（1）在灭菌后的微量离心管中按下表用量分别加入模板DNAdNTP混合液引物1引物2TaqDNA聚合酶双蒸水PCR缓

8、冲液（含Mg2+）1L1L1L1L1L11L4L总体积20ulEP管（因由eppendorf公司生产)DNA片段的PCR扩增步骤：（2）将PCR管放入PCR仪内，按下表设定PCR的反应程序预变性95℃5min30个循环95℃30sec55℃30sec72℃1min终反应72℃5min迷你离心机PCR仪DNA图谱观察仪