多聚酶链式反应扩增DNA片段ppt课件.ppt

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1、课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段课程标准尝试PCR技术的基本操作和应用。课标解读1.理解PCR技术的基本原理。2.知道PCR技术的基本操作过程。3.讨论PCR技术的应用。1．生物体内DNA分子复制的条件(1)四种是合成子链的原料。(2)提供了DNA复制的模板。(3)打开了DNA双链。(4)催化合成DNA子链。(5)使DNA聚合酶能够从开始连接脱氧核苷酸。PCR技术的原理及反应过程脱氧核苷酸DNA母链解旋酶DNA聚合酶引物引物的3′端2．PCR扩增的原理及条件(1)概念PCR即，是一种迅速的技术。

2、它能以极少量的为模板，在短时间内复制出上百万份的。(2)原理①DNA的热变性：在的温度范围内，DNA双螺旋结构解体，双链分开，这个过程称为。当温度缓慢后，两条彼此分离的DNA链又会重新。②子链的合成：a.需要；b.合成方向总是从子链的端向端延伸。多聚酶链式反应体外扩增DNA片段DNADNA拷贝80～100℃变性降低结合成双链引物5′3′(3)条件①模板。②分别与模板DNA两条模板链相结合的两种。③A、T、G、C四种。④耐热DNA聚合酶，一般用。⑤需要一定的和能严格控制的温控设备。DNA引物脱氧核苷

3、酸耐高温的TaqDNA聚合酶缓冲溶液温度3．PCR反应过程PCR一般要经历次循环，每次循环可以分为、和三步。(1)：当温度上升到以上时，双链DNA解聚为单链。(2)：温度下降到左右，通过与两条单链DNA结合。(3)：温度上升到左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。三十多变性复性延伸变性90℃复性50℃两种引物碱基互补配对延伸72℃DNA聚合酶[思维激活1]DNA复制缘何必须有引物？提示DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能以3′延伸DNA链，故DNA合成时，

4、必须加入引物(其3′游离)以作为延长DNA子链的“引子”。1．细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增的比较(见下表)项目DNA复制PCR扩增不同点场所细胞内细胞外能量ATP提供能量不需ATP提供能量酶解旋酶、DNA聚合酶耐热的TaqDNA聚合酶是否有转录伴有转录、产生引物无转录、需加入两种引物特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增循环次数受生物体自身控制30多次缓冲液不需要需要人为控制设备无需要严格控制温度变化的温控设备相同点原料四种脱氧核苷酸复制原理严格遵循碱基互补配对原则模板DNA为模板引物都需

5、要与模板相结合的引物2.PCR过程(1)变性当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。(2)复性温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)延伸温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。特别提醒(1)72℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸。(2)DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使该段固定长度的序列呈“指数式”扩增。【

6、巩固1】标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是()。A．94℃、55℃、72℃B．72℃、55℃、94℃C．55℃、94℃、72℃D．80℃、55℃、72℃解析当温度上升到90℃(90～96℃)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50℃(40～60℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72℃(70～75℃)时，溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。答案A

7、1．实验用具(1)PCR仪：该仪器能自动调控，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个代替，操作时按程序在3个中PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管：总容积为，实际上是进行的场所。(3)微量移液器：用于。PCR技术的实验操作及评价温度恒温水浴锅水浴锅来回转移0.5mL多聚酶链式反应转移PCR配方中的液体2．操作步骤准备→→混合→→反应。3．操作提示(1)为避免等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行。(2)所用的和应分装成小份，并在储存。(3)在中添加反应成分时，每吸取一种试剂后

8、，移液器上的枪头必须。加入组分设置PCR的循环程序外源DNA高压灭菌缓冲液酶－20℃微量离心管更换[思维激活2]PCR操作中模板DNA是否需解旋？需要旋转酶吗？提示PCR操作中，模板DNA仍需解旋，但该解旋过程不是DNA解旋酶催化的结果，而是利用DNA热变性的原理，在80～100℃温度范围内，DNA双螺旋结构将解体，双链分开，以此达到解旋的目的。1．PCR仪：PCR自动化程度较高，参照下表设计程序即可。循环数变　性复　性延伸第1次94℃，10min－－30次94℃，30s55℃，3