质粒DNA的提取和PCR技术.ppt

《质粒DNA的提取和PCR技术.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在PPT专区-天天文库。

1、质粒DNA的提取和PCR技术质粒提取基本原理操作步骤注意事项实验室安全基本原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份.质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，碱裂解法是最常用的方法。基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与线性DNA发生变性，质粒释放到上清中。当加入中和液后，因为闭环的质粒DNA分子虽然氢键破坏但双链并不分离。能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA变性相互缠绕成

2、大分子复合物而呈絮状被SDS覆盖，当加入溶液三后形成PDS被离心时可沉淀下来。试剂准备：1.溶液Ⅰ:50mM葡萄糖平衡渗透压，调节PH值，有利悬浮。25mMTris-HCl(pH8.0)调节PH值10mMEDTA(pH8.0）鏊和离子抑制DNase活性高压灭菌15min，贮存于4℃2.溶液Ⅱ：0.2NNaOH，1%SDS裂解细菌，变性线性DNA3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH4.8中和PH值，并与SDS作用沉淀4.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）苯酚变性抽提蛋白，为tris-base平衡酚。氯仿防止苯酚与水互溶。

3、异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少泡沫5.异丙醇，乙醇（无水乙醇、70%乙醇）沉淀质粒6.TE：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)。RNaseA：10mg/ml操作步骤及注意事项1挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，于37℃振荡培养14～18h。-培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。影响质粒质量。2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心12000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分

4、散混匀。4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解,DNA变性。-放置时间不能太长。因为在碱性条件下基因组DNA会慢慢断裂。混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置3-5min。-中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。6.12000g离心10min取

5、上清，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心12000g10min。-抽提掉剩余蛋白。7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入0.5~0.7倍体积的异丙醇，混匀，4℃离心12000g，10min。-可以用两倍体积的无水乙醇，室温放置2-5min离心。不要沉淀太久8.1ml75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃离心，弃上清，将沉淀在室温下晾干。-不要太干，否则不易溶解。9.沉淀溶于20μlTE（含RNaseA20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。10.琼脂糖电泳检测。检测，定量。其它注意

6、事项：1。质粒质量：首先实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。其次操作过程注意：避免基因组断裂，除净蛋白，盐离子清洗干净。质粒数量：同量摇菌量中质粒量取决于质粒拷贝数。低拷贝数质粒可以通过添加氯霉素来增大拷贝数。2。阳性菌破壁裂解比较困难，可以先用溶菌酶处理。溶液二中NaOH不要暴露在空气中太久。可能会与空气中的CO2与NaOH作用,减弱了其碱性。3。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时如果能看到三条带，这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全

7、的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提得到质粒样品中应不含线性DNA，另外如果发现运动得较慢的带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。实验室安全：1。培养细菌的容器用过后都要及时进行灭菌，细菌培养基上清不要随便丢弃，应存放在一起进行灭菌处理，以免污染环境。2。吸取苯酚时应注意安全。苯酚腐蚀性很强。吸取氯仿异戊醇时要在通风橱中进行，氯仿可引起神经系统功能紊乱要引起肝脏损害。异戊醇其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用3。电泳时注意避免EB污染。PCR技术基本原理反应动力学使用步骤及注意事项反应参数要素P

8、CR优化PCR技术聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。