质粒DNA的提取、定量、酶切和PCR鉴定

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1、南方i8科丈修生物化学实验报告名：宋黎明学号3130010006专业年级：2013级临床医学二组另IJ:第一实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称(TitleofExperimetn)质粒仞/%的理取、定量、酶切和比氏鉴定实验日期(DateofExperiment)2014-11-13实验地点(LabNo.)弟—窠验室合作者(Partner)指导老师(Instructor)V总分(TotalScore)86教师签名(Signature)批改日期(Date)2015亠7一、实验目的1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法2、掌握碱裂解法提取质粒的方法3、了解紫外吸收

2、法检测DNA浓度与纯度的原理、方法4、学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作二、实验原理1、高纯质粒小量制备(试剂盒法，离心柱型)碱裂解法：①基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；②高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；③当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉淀去除；用改进碱裂解法提取质粒，吸附柱内的吸附膜在高盐、低PH状态下选择性结合溶液中的质粒DNA。蛋白液和漂洗液可以将其他杂质去除。低盐和高PH的缓冲液将纯净的质粒DNA从吸附膜上洗脱。2、聚合酶链式反应(Polymer

3、aseChainReaction,PCR)PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应，是指在耐高温DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。变性：加热使模板DNA在高温下90°C-95变性，双链解链。退火：降低溶液温度，使合成引物在低温(35-70°C,—般低于模板Tm值的5左右的模板DNA互补退火形成部分双链。延伸：溶液反应温度升至中温72°C,在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。不断重复上述过程以实现DN

4、A的体外大量扩增。3、质粒DNA的定量(紫外分光光度法)DNA碱基上存在共窥体系，对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰且吸收的强度和DNA的浓度呈正比。当A26o=1时，双链DNA溶液的浓度为50

5、ig/ml•蛋白质由于色氨酸和酪氨酸的存在，其最大吸收波长是280n叫可以通过测定样品在260nm和280nm的吸光度比值(A26°/A28o),估计DNA的纯度。此外紫外分光光度法只能测量浓度＞0・25皑/ml的DNA溶液。4、质粒DNA的酶切鉴定①限制性核酸内切酶是一种识别双链DNA分子的特别序列并在一定部位切断磷酸二酯键水解DNA的酶类。实验使用的“Eco"核酸内切酶

6、和刃沁TH核酸内切酶分别特异性识别5-GIAATTC-3,和AJAGCTT序列并在箭头所示的位置打开磷酸二酯键。不同的质粒DNA含有不同的碱基序列因而含有的酶切位点的种类和数目也不相同，即有不同的酶切图谱。通过选择合适的限制性核酸内切酶把质粒DNA切割成不同大小的DNA片段，在电泳中，根据区带数以及片段迁移的位置，以已知分子量的线性DNA片段为参照，可以判断酶切片段的大小，从而对提取的质粒进行鉴定。②琼脂糖凝胶电泳：f琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度；DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；DN

7、A分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA,分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、实验材料1、高纯质粒小量制备(试剂盒法、吸附柱型)①仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅②材料：含PMD18-T质粒的大肠杆菌DH5(xa③试剂：LB培养基(液体、固体)、兄试剂盒质粒提取试剂盒(爱思进，中国)内含：溶液Pl(S1)、溶液P2(S2)、溶液P3(S3)、去蛋白液PE(W1)、漂洗液WB(W2)、洗脱液EB(Eluent)o2、聚合酶链式反应(Polymeras

8、eChainReaction,PCR)①仪器：PCR仪(BioRadMJmini)、小型台式离心机(Sigma1-14).微量加样枪灭菌的薄壁离心管②材料：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD18-T)、引物：正向：5，GTAAAACGACGGCCAGT3'反向：5’CAGGAAACAGCTATGAC3'2xPremixTaq:Taq酶：5U/卩1、4xdNTP:各10mmol/L、10x缓冲液(buffer):500mmol/LKC1,1OOmmol/LTris-HCl、灭菌去离子水3、质粒DNA的定量（紫外分光光度法）核