质粒的提取和鉴定,dna酶切

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1、碱变性法小量提取质粒，DNA的限制性酶切厦门大学医学院分子生物学实验教学组实验目的掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。掌握质粒酶切鉴定原理,学会根据目的基因和实验目的选择合适载体与限制性内切酶，设计构建体外重组分子。质粒(plasmid)是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）和细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因工程中质粒常被用做基因的载体。是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）和细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基

2、因工程中质粒常被用做基因的载体。分离质粒DNA的基本步骤培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA质粒DNA的提取方法碱变性法（碱裂解法）；煮沸裂解法；羟基磷灰石柱层析法；质粒DNA释放法；酸酚法等。碱变性（裂解）法基本原理：在碱性条件下（pH12.6），染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形

3、成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。原理示意图质粒DNA电泳电场中DNA分子的迁移速度取决于：DNA分子本身的大小DNA分子的空间构型超螺旋构型（ccDNA)线形DNA(lDNA)开链环状DNA(ocDNA)复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起)溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光Attention,please!EB是

4、强诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去！质粒提取实验材料与试剂实验材料：过夜培养大肠杆菌DH-5a实验试剂：LB培养基0.1MNaCL、10mMTris.CL（pH8.0）、1mMEDTA、Amp50mg/ml、酚、氯仿、Rnase、琼脂糖TE：10mMTris.CL（pH8.0），1mMEDTA溶菌酶10mg/ml（用10mMTris.CL，pH8.0，新鲜配制）溶液Ⅰ—溶菌液：50mM葡萄糖，25mMT

5、ris.Cl（pH8.0），10mMEDTA，2mg/ml溶菌酶。溶液Ⅱ—NaOH-SDS液：0.2NNaOH，1%SDS。溶液Ⅲ—3mol/LNaAc（pH4.8）溶液：5MKAC10ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml。步骤一细菌培养与质粒扩增1.挑单克隆E.coli菌株接种到4mlLB培养液中（含Amp50µg/ml），37℃225rpm振荡培养过夜。（活化菌种）2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中，37℃振荡培养3-4小时（OD600＝1.0）3.取4ml培养液至Eppendor

6、f管中，12000rpm，4℃离心30秒，弃上清，用1mlSTE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。步骤二质粒提取取4ml培养物至Eppendorf管中，12000rpm，4℃，离心30sec，弃上清。用1mlSTE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥。将细菌沉淀悬浮于100μl预冷的溶液I中，加入10µl溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰上放置1分钟。加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将E

7、ppendorf管放在冰上3分钟。5.加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。6.12000rpm，4℃离心5min，将上清夜转至另一1.5mlEppendorf管中。7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放置5-10min，12000rpm，4℃下离心2分钟，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000rpm4℃离心5分钟。9.倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗DNA沉淀。120

8、00rpm，4℃离心2分钟。10．弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放置5min。室温放置15min干燥。11．50µlTE缓冲液(含无DNase的RNase20µg/ml)，使DNA完全溶解（-20℃保存）12．取样品10µl加2ul6×Loadingbuffer于1%琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。MpBSKpGFP菌体老化碱裂解不充分菌体中无质粒溶液使用不当请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液