质粒DNA酶切鉴定

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1、实验五质粒DNA的微量提取及酶切鉴定字体：A质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够白主复制的环形双链DNA分子。一、质粒DNA的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增;菌体的收集裂解；质粒DNA的分离和纯化。1、细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于高拷贝的质粒（pUC系列）来说，只要将培养物放到标准的LB或TB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。但对于拷贝数较低的质粒（如PBR322）来说，则需在得到部分生长的细菌培

2、养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。因为氯霉素可以抑制宿主菌的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，但是质粒则仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续上升。（问题：提取质粒时，对于不同拷贝的质粒，应如何进行细菌的培养？为什么？）2、细菌的收集、裂解和质粒DNA的分离细菌的收集可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采取多种方法，包括用非离子型去污剂、有机溶剂或碱处理及加热处理等。质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：a.大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多

3、。b.从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。利用溶菌酶和加热处理的方法，使细菌的线状染色体DNA变性，通过离心，可以使染色体DNA和变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒分子仍留于上清中。问题1：某些大肠杆菌的菌株不能用加热的方法裂解。（1）易产生多糖的如大肠杆菌菌株，如HB101和TG1等。尤其是HB101的一些变种和衍生物，在用去污剂或加热裂解时可释放处相对大量的糖，从而影响质粒的纯化，抑制多种限制性内切酶的活性。（2）表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（日?旳+）,如HB101。

4、因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A,以后在存在下温育（如用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。但通过一个附加步骤（用酚：氯仿进行抽提）可易避免此问题。3、质粒DNA的纯化纯化质粒DA的方法很多，通常使用的方法都是利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状这两个基木性质。多年来，氯化锥T臭化乙锭梯度平衡离心一育•是制备大量质粒DM的方法，然而该过程既昂贵又费吋，为此发展了许多代替方法，其屮主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀（聚乙二醇和LiCI分级沉淀法）等分离质粒DA和宿主DNA的方法。对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚抽提、RN

5、A酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余蛋白和RNA,达到纯化的目的。二、质粒在细胞内的复制，一般分两种类型：严密控制型（stringentcontrol）:只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。松弛控制型（relaxedcontrol）:质粒在整个细胞周期屮随时可以复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。三、质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环状D7A（cccDNA,SC构型）、开环DM（0C构型）和线形分子（L构型）。在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝

6、胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA,尽管分子量相同，但是有不同的电泳迁移率。其中走在最前沿的是SCDNA,其后依次是LDNA和OCDNAO3000250010007500CDXALDNASCDXA四、质粒DA微量提取程序。五、限制性内切酶酶切注意事项在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题:1.加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10,避免限制酶活性受到甘油的影响。大多数限制酶

7、贮存在50%甘油溶液中，以避免在-20°C条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12%时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性,更高浓度的甘油会抑制酶活性。2.多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在012%）；⑥有机溶剂的存在。3.反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的D7A浓度为0.1-0.4ug/ulo4.当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时

8、，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液屮活性高的酶切割DNA,然后加入