质粒dna的提取、定量、酶切与pcr鉴定

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1、质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.掌握PCR基因扩增的原理和操作方法2.掌握碱裂解法提取质粒的方法3.了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板

2、Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多

3、糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8DNA纯净A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260

4、/A280>1.8含RNA杂质，用RNA酶去除。4.质粒DNA的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。3.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).

5、三、材料与方法：（一）实验材料：1.PCR仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌液[大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)]、无菌去离子水、2×PremixTaq、引物2.质粒DNA的提取与制备仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管材料：溶液P1（S1）、溶液P2(S2）、溶液P3（S3）、去蛋白液PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脱液EB（Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α3.质粒DNA的定量（紫外分光光度法）仪器：紫外分光光度计、比色杯、微量加样枪材料：质粒Ｄ

6、ＮＡ、蒸馏水4.质粒DNA的酶切鉴定仪器：微量加样枪、1.5mlEP管材料：无菌水、质粒DNA、10×M酶切缓冲液BufR、EcoRI(12U/ul)、HindIII(15U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶成像系统凝、胶电泳系统材料：电泳指示剂、琼脂糖、Gelview、TBE、DNAMarker5000、电泳缓冲液（二）实验方法准备目的DNA：煮沸菌液10分钟，冷冻，室温解冻后离心，取上清液1.PCR取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪照下述顺序加入：灭菌去离子水5.5μl、2*PremixTaq12.5μl、引物1(10mol/L)1μl、引物2(10mol/L)1μl、

7、菌液5μl将PCR反应管置台式离心机中短时离心，以使黏附在PCR管壁上的液滴聚集在底部将装有PCR反应系的反应管放入PCR仪上进行如下操作：①94℃预变性5分钟②循环：94℃—30s，50℃—30s，72℃—1min。循环为30次③72℃5分钟④4℃,保温将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中2.质粒DNA的提取与制备取1.5ml培养物加入EP管13,000rpm离心1分钟，除上清液滴加溶液S1250μl并吹打分散细菌沉淀滴