质粒dna的提取定量酶切鉴定与pcr实验报告

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1、生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量、酶切鉴定与PCR实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用TimesNewRoman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。一、实验目的1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法2、掌握碱裂解法提取质粒的方法3、了解和掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理和测定方法4、了解质粒酶切鉴定原理

2、5、学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小二、实验原理1、PCR：在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。PCR一次循环的具体反应步骤为：（1）变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。（2）退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35~70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。（3）延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq

3、酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。2、质粒DNA的提取：（1）碱裂解法：1）基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：2）高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；3）当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。（2）离心层析柱：1）硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；2）通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它

4、细菌成分去除； 3）低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。3、质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：1）物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性。2）各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。3）A260/A280比值可以反应DNA的纯度。4、质粒DNA的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、

5、5或6个核苷酸的反向重复序列。5、琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、材料与方法：以流程图示意（一）材料：1、PCR:仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌液：(大肠杆菌DH5a菌株，含靶基因CHD5片段的p

6、MD19-T)、无菌去离子水、2×PremixTaq、引物2、质粒DNA的提取仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅材料：含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5αa试剂：溶液S1、溶液S2、溶液S3、去蛋白液W1、漂洗液W2、洗脱液Eluent3、质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸馏水、质粒ＤＮＡ4、质粒DNA的酶切鉴定仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪材料：无菌水、10×M酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/u

7、l)5、琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液方法：1、PCR取0.2mlPCR反应管一只用微量加样枪加入灭菌去离子水6.0μl 6ml 12ml将反应管放到PCR仪上进行扩增加入2*PremixTaq12.0μl加入引物1-SO100(10μmol/L)1.0μl加入引物2-SO101(10μmol/L)1,0μl加入菌液5.0μl离心10min2、质粒DNA的提取旋涡振荡悬浮沉淀加250.0μl溶液S1离心13000rpm,10min弃

8、滤液，加入500.0μl漂洗液W2弃滤液，加入500.0μl去蛋白液W1取上清700.0μl加到吸附柱中颠倒6-8次加250.0μl溶液S2菌液离心并弃上清液加400.0μl溶液S3颠倒数次，放置3-5min离心1300