0质粒dna的提取定量酶切与pcr鉴定-第3实验室

《0质粒dna的提取定量酶切与pcr鉴定-第3实验室》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：第三组第3实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验日期2014-12-04实验地点第3实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.掌握PCR基因扩增的原理和操作方法2.掌握碱裂解法提取质粒的方法3.了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作二、实验原理1.PCR（多聚酶链式反应）在DNA聚合酶催化下，可以DXA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DN

2、A按2n方式呈指数形式扩增。PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95°C，使模板DNA在高温卜*完全变性，双链解链B.退火逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35—7CTC，一般低于模板Tm值的5°C左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。C.延伸：溶液反应温度升至中温72°C,在Taq酶作用卜*,以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火延伸为一条双链。2.质粒DNA提取与定量（1）碱裂解法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异;高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，

3、变性的质粒DXA复性并保存在溶液巾，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除；(2)离心M析柱硅基质膜在高盐、低pH值状态不选择性地结合溶液中的质粒DNA,不吸附蛋白质、多糖等物质；通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜_h洗脱；(3)紫外光吸收法1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2,而凡物质对光的吸收是其有选择性的3,各种不同的物质都其有其各Q的吸收光谱4,质粒DNA的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基木工其。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别

4、序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。5,琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分了，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分了在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向止极泳动.DNA分了在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分了量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分了量的对数值成反比关系).三、材料与方法：(一)材料1.PCR(多聚酶链式反应)PCR仪(BioRadMJmini),台式离心机、微量加样枪，灭菌的薄壁离心管菌液【大脉杆菌D

5、H5a菌株(pMD19-T质粒，含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离了•水、2XPremixTaq、引物2.质粒DNA提取与定量仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心M析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管材料：溶液Pl(S1)、溶液P2(S2)、溶液P3(S3)、去蛋白液PE(W1)、漂洗液WB(W2)、洗脱液EB(Eluent)、含pMD19_T质粒的大肠杆菌DH5a3.质粒DNA的定量(紫外分光光度法)仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：无菌去离了水、质粒DNA4.质粒DNA的酶切鉴定仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪、恒温箱材料：无

6、菌水、10XM酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液(二)实验步骤1.PCR扩增取0.2mlPCR反应管一只用微量加样枪分别加入6u1灭菌去离子水、12ul2XPremixTaq>lul引物1、U1引物2、5ul菌液(注意：每加一种样就要换一种加样枪头)待反应液集中于反应管底部，将反应管放到PCR仪上进行扩增将扩增后的基闪用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔屮1.质粒DNA的提取与制

7、备取1.5ml培养物加入Eppendorf管中加入250P1溶液S1,吹打，使细尚沉淀分散，彻底悬浮。加入250ul溶液S2,颠倒6〜10次混匀(不要剧烈振荡)，直到溶液变得清亮.加入400ul溶液S3,立即温和混匀，室温放置3-5min。13000rpm离心lOmin，小心取上清液(700-800ul)o将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液。加入500m1去蛋白液(Wl),13000rpm离心lmin,弃滤液向吸附柱中加入700ul漂洗液W2,13000rpm离心lmin,弃滤液。再重复一次。空柱13000i

8、、pm离心