质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定实验报告(精选)

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1、质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。二、实验原理1.PCR（多聚酶链式反应）在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料,通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA,使目的DNA按2"方式呈指数形式扩增。PCR

2、一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95°C,使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35—70°C,—般低于模板Tm值的5°C左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。C.延伸：溶液反应温度升至中温72°C,在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火Z后延伸为一条双链。2.质粒DNA的提取与制备（1）•碱裂解法:染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性;A

3、.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。（2）・离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA,而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。1.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）:A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具

4、有其各口的吸收光谱：DNA分对波长260nm的紫外光有特界的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特界的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特界的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8DNA纯净A260/A280<1.8表示样品屮含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8含RNA杂质，用RNA酶去除。2.质粒DNA的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特杲性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DN

5、A序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNAo1.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分了，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分了在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向止极泳动。DNA分了在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分了筛效应：不同的DNA,分了量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分了量的对数值成反比关系).三、材料与方法：(-)实验材料：1.PCR仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌

6、液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2XPremixTaq、引物2•质粒DNA的提取与制备仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管材料：溶液Pl(S1)、溶液P2(S2)、溶液P3(S3)、去蛋白液PE(W1)漂洗液WB(W2)、洗脱液EB(Eluent).含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5a3•质粒DNA的定量(紫外分光光度法)仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸憾水、质粒DNA4.质粒DNA的

7、酶切鉴定仪器:1.5ml的EP管、微量加样枪材料：无菌水、10xM酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII(15U/ul)>EcoRI(12U/ul)1.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液(-)实验方法1.PCR准备H的DNA：菌液煮沸lOmin,冷冻，室温解冻后离心取上清液取0.2n)lPCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入：灭菌去离子水5.5口1、2*PremixTaql2.5ul>引物1(1

8、0mol/L)ljiR引物2(10mol/L)1山、菌液5yl<丿将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心将装有PCR反应体系的PCR反应管放入PCR仪上进行如下操作：①94°C预变性5分钟后开始以下循环②循环为94°C——30秒,50°C——30秒，72°C——1分钟。循环为30次③72°C5分钟@4°C保温JI将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中2.质粒DNA的提取与制备取1