质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定

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1、质粒DNA的限制性内切酶酶切及其鉴定!1!!1!［实验目的］训练学生正确使用加样器；了解限制性内切酶及酶切条；学会分析质粒DNA的酶切图谱；系统掌握琼脂凝胶电泳的基本技术。［实验原理］限制性内切核酸酶（也口J称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌细胞内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNAT基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。由于细胞毎存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破坏，而对感染的外來噬

2、菌体DNA,因无甲基化而被切割破坏。所以限制性内切酶是该细菌细胞的卫士，它与DNA甲基化酶一齐构成了保护口己、抵抗外源入侵的DNA防御机制。目前已发现的限制性内切酶有数百种。EcoRI和HindIII都属于II型限制性内切酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子的特界核昔酸顺序的能力,能在这个特异性核昔酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片断。EcoRI和HindIII的识别序列的切口是:EcoRI:GJAATTCHindIII:A^AGCTTGA等核苛酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DN

3、A有多少切口，就能产生多少个酶切片段，因此鉴定酶切后的片断在电泳凝胶中的区带数，就口J以推断酶切口的数目，从片断的迁移率可以人致判断酶切片段大小的羌别。用已知相对分了质量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测岀分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。［实验器材］1•仪器和材料电泳仪、电泳槽，样品槽横板（梳子），有机玻璃内槽，橡皮膏，锥形瓶（lOOmL或50mL）,玻璃纸，一次性塑料手套。pUC19（市售和自捉），EcoRI酶，入DNA-HindIII酶切的分子量标准、琼脂糖。2•试剂（1）TAE缓冲液（1XTAE）：称取

4、Tris4・9g、EDTA・Na2—2H2O0.74g,用900ml蒸憾水分别溶解后，添加冰醋酸1.14ml,最终用蒸徭水定容至1L。（2）酶反应终止液（10X）：两种反应终止液可供选择。①0.1mol/LEDTA-Na2,20%FiCoLL,适量橙G。②0.25%溟酚蓝，0.25%二甲苯青FF（或称二甲苯蓝）,40%蔗糖水溶液（m/V）（或用30%蔗糖水溶液）。［实验步骤］1,质粒DNA的酶解编号123456市售的pUC19（微升）003300自提的pUC19（微升）660066EcoRI（微升）202020Buffer5X22222

5、2H20/（微升）023502总体积/（微升）101010101010质粒DNA酶解的反应成分及加样量2,琼脂糖凝胶板的制备（1）琼脂糖凝胶的制备：称取0.14g琼脂糖，置于蓝盖试剂瓶屮，加入20mlTAE缓冲液，置于高压灭菌锅内加热，锅内压力为至121kPa时维持lOmin,琼脂糖即可全部融化在缓冲液中，取出摇匀，则为0.7%琼脂糖凝胶液。（2）胶板的制备：取有机玻璃内槽，洗净、晾干。（3）放好样品加样孔合适的梳子。（4）将冷却至65度左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表

6、面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右。（5）待凝胶完全凝固后，将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽内备用，加入足量电泳缓冲液。（6）轻轻拔出梳子。3,加样（1）预先染色DNA（2）用微量加样器将样品加入胶版的样品小槽内，加样时枪头垂宜于样品槽上方，注意不能碰到样品槽的凝胶面。（3）每次加完一个样品，及时更换枪头，以防止相互污染。加样时，应防止碰坏样品槽周围的凝胶面。4,电泳正确连接正负极，DNA向正极移动。加完样品后的凝胶板立即通电，进行电泳。但要注意控制一定的条件，样品进胶前，应使电流控制在30mA,样品进胶后电流为30mA。当橙G或

7、澳酚兰染料移动到距离胶板下沿约1〜2cm处，停止电泳。5,拍照观察［实验结果］［结杲分析］