质粒dna的制备限制性内切酶切割重组质粒课件

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1、质粒DNA的制备限制性内切酶切割重组质粒朱文博中山医学院基因克隆定义：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。基因工程定义：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为基因工程，又称重组DNA技术。基因克隆示意图分、切接转筛基因载体基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。实验内容2.限制性内切酶

2、的酶切鉴定(P82)3.定性鉴定:DNA的琼脂糖凝胶电泳4.定量检测：DNA的紫外分光光度法测定(P39)1.质粒DNA的提取与纯化(P70碱法)实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用;掌握核酸内切酶切割质粒的原理并学会运用内切酶一.质粒DNA的提取1关于质粒的概念a.什么是质粒（plasmid）？b.质粒的本质是什么？c.质粒有哪些构型？c.质粒有哪些特点？d.质粒的用途有哪些？81.1质粒的定义质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整

3、合到宿主染色体上。在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。9(1)超螺旋DNA(supercoiledDNA,SCDNA)1.2质粒的三种构型10(2)开环DNA(opencircularDNA,OCDNA)如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。11(3)线状DNA(linearDNA,LDNA):如果两条链均断开，即为线状DNA。电泳时，三者泳动速度大小关系（？？？）12最快中最慢1.3质粒DNA的基本特征：(1)自主复制性：能独立于染色体DNA外自主复制；

4、(2)可扩增性：严紧型复制-复制1-5个拷贝松弛型复制-复制数十个拷贝；(3)可转移性：通过细菌结合作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞；(4)不相容性：具有相似复制子结构特征的两种不同质粒不能稳定地存在于同一受体细胞内。141.4理想的克隆载体：(1)分子质量小、多拷贝、松弛控制型；(2)具有多种常用的限制酶的单切点；(3)能插入较大的外源DNA片段；(4)具有容易操作的检测表型。15151.4提取质粒DNA的目的与意义：基因载体/基因克隆/基因工程2.1提取质粒DNA的常规方法(1)SDS碱裂解法(2)煮沸

5、法(3)highpureplasmidisolationkit等。但原理相似，都是利用宿主染色体DNA和质粒DNA的差异来分离的：★宿主菌染色体DNA通常比质粒DNA要大得多★纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒DNA呈闭合环的形式。2提取大肠杆菌质粒DNA的方法和原则2.2分离纯化质粒DNA的主要步骤(1)培养细菌使质粒扩增（DNA的扩增与选择）(2)细菌的收集与裂解收集方法：高速离心的方法裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、碱变性法、沸水热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解

6、后的纯化方法等因素综合后加以选择。(3)质粒DNA的纯化常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等所有纯化方法都是利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状的性质。2.3核酸分离纯化的总原则：(1)保证核酸一级结构完整(2)排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、其他DNA、RNA等）3.SDS-碱裂解法提取Puc119-U6重组质粒DNA3.1实验原理：高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。①质粒DNA不

7、发生断裂，保持双链闭合环状；②双链DNA并不完全分离。高酸中和至中性变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质3.2主要试剂及作用溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris•HCl组成.(保护、缓冲)①葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒.(保护作用)②EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护作用）③Tris•HCl能

8、使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）21溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成(裂解、变性)①SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）②NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）22溶液III：HAC(乙酸)和KAC(乙酸钾)组成的高盐溶液(复性，分离)①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱