质粒DNA的提取与酶切鉴定

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1、实验四质粒DNA的提取与酶切鉴定一.实验目的和要求1、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA的方法；2、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法；通过本实验了解限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。二.实验原理1、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的的，在pH12.0～12.6的碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中

2、性并在高盐浓度下，已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。2、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、III型三大类，Ⅰ类和III类限制性内切酶，在同一蛋白

3、分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合处的DNA。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛。其基本特点如下：(1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoRI识别与切割序列为5`····GAATTC····3`3`····CTTAAG····5`(2)、识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别8～13个；(3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端：(4)、有不同来源的限制性

4、内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称为同裂酶或异源同工酶，如HpaII与MspI；有的识别位点不同，但对DNA切割后可产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamHI与BglII。三．实验材料与设备：超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；1.5mL与0.5mLEppendorf管、Tip头、烧杯、量筒试剂：LB培养基氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL；溶液I:50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA(pH8.0)，

5、25mmol/LTris-HCl(pH8.0)；溶液II:0.2mol/LNaOH,1%SDS(现配现用)；溶液III:乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)(60mL的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2O)；RNaseA：10mg/ml；TE缓冲液:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0；5×TBE缓冲液：0.45mol/LTris－硼酸，0.01mol/LEDTA,pH8.0；10×Loadingbuffer：1%SDS,0.05%溴酚兰，50％的甘油；无水乙醇；70％乙醇；标准分子量片段；核酸内切酶EcoRI(TaKa

6、Ra)；EcoRI酶解缓冲液(10×bufferH)；琼脂糖；溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。四、碱裂解法小量制备质粒DNA1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37℃震荡培养12～16小时；2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000g离心30Sec，弃上清液，在吸水纸上扣干；离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮3、加入100L预冷的溶液I，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程中的机械剪切力，防止染色体DNA的断裂；EDTA的作用是与二价离子（Ca2＋）结合，降低

7、DNase对DNA的降解4、加入200L新配制的溶液II,盖紧管口,快速颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3－5min;溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构5、加入150l溶液III,加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min；溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性6、12000g离心6min，将上清移入另一干净的Ep管中；7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇,振荡混匀，室温放置2