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1、实验三、四 质粒DNA的提取与PCR2012.10实验三、质粒的提取与电泳检测一、实验目的：1.学习利用碱变性方法提取细菌中的质粒DNA。2.掌握利用琼脂糖凝胶电泳方法检测质粒DNA二、实验原理：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。相对分子质量一般约为细菌染色体的0.5%-3%,在1Kb-200Kb
2、之间。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，将质粒DNA释放到上清液中。碱性溶剂使碱基配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然地超螺旋结构。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，与PDS一起沉淀。离心除去变性剂，
3、从上清液中回收复性的质粒DNA。3.质粒DNA的琼脂糖凝胶检测DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。在细菌的细胞内，质粒以超螺旋形式（cccDNA）存在。在提取质粒的过程中，还有另外两种存在形式：线性（linearDNA）和松弛型(ocDNA)。三.试剂:◆溶液Ｉ50mmol/L葡萄糖
4、25mmol/LTris．Cl(pH8.0) 10mmol/LEDTA(pH8.0)◆溶液Ⅱ 0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS◆溶液Ⅲ 5mol/Ｌ乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml◆异丙醇◆无水乙醇四.试验步骤:(1)培养细菌:大肠杆菌接种到LB培养基2ml-5ml中,37度振荡培养8-16小时.(2)取培养液1.5ml于Eppendorf管中,12000rpm离心3分钟,去掉上清液，重复收集一次。加入300ul溶液Ｉ,充分吹打混匀后,室温放置5分钟.(3)加入300ul新配置的溶液Ⅱ（100ulNaOH+
5、100ulSDS,用蒸馏水稀释至10ml）,轻柔颠倒5-10次,零下20度放置5分钟.(4)加入300ul溶液Ⅲ,颠倒5-10次,放置5分钟.(5)12000rpm离心15分钟,取上清液（不大于700ul）于一新的Eppendorf管.加入等体积异丙醇,混匀后放置5分钟,12000rpm离心10分钟,弃去上清.(6)用无水乙醇清洗一次,离心管倒置在吸水纸上2min,自然干燥.(7)加入20ulTE溶液溶解提取物,充分溶解.(8)琼脂糖凝胶电泳检测提取结果.五、电泳检测试验结果六、结果分析思考题:电泳结果出现几个条带?各是什么?为什么这一方法被称为碱变性法？溶液1,
6、2,3在其中各起到什么作用？实验四、PCR扩增目的基因实验目的：1.学习PCR实验操作与原理2.掌握PCR扩增基因电泳检测方法二.PCR实验原理三.试剂:1.Taq酶：Mix2.引物1,23.模版：质粒DNA4.灭菌水5.0.2ulEppendorf管四.试验步骤:（一）PCR体系：PCRMix10ulH2O9ul引物10.5ul引物20.5ul质粒模版0.5ul(二)PCR循环条件94℃3min94℃30s60℃30s30cycle72℃1min72℃7min4℃forever电泳检测实验结果
