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1、质粒DNA的提取、定量 酶切鉴定http://jpkc.fimmu.com/sfzx/南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心ExpertimentalTeachingCenterofBiochemistryandMolecularBiology实验内容提取原理操作步骤计算方法操作步骤质粒DNA定量酶切原理酶切步骤酶切电泳原理电泳步骤电泳2.质粒DNA提取原理3.质粒DNA操作步骤4.紫外检测定量知识5.酶切原理、操作步骤6.琼脂糖电泳原理及步骤7.凝胶成像系统质粒DNA的提取酶切分析质粒定量琼脂糖凝胶电泳实验流程实验目的掌握碱裂解法提取质粒的方法了解
2、紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作第二部分质粒DNA提取与定量ExtractionandQuantitationofPlasmidDNA独立于细菌染色替外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；存在于细菌，放线菌，真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多．质粒（Ｐlasmid）定义碱裂解法煮沸裂解羟基磷灰石柱层析法质粒DNA释放法酸酚法等方法选择哪一种方法主要取决以下几个因素：质粒的大小大肠杆菌菌株裂解后用于纯化的技术和实验要求分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA分离质
3、粒DNA三步曲分离质粒收集裂解细菌质粒扩增基本步骤基本原理1、碱裂解法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉定去除；2、离心层析柱基本原理硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA；去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；☆原理示意图（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌
4、锅（二）材料：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5α（三）试剂：LB培养基（液体、固体）Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）溶液P1溶液P2溶液P3去蛋白液PE漂洗液WB洗脱液EB仪器材料50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块溶液I0.2mol/LNaOH1%SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。注意：时间勿太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次溶液II5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5m
5、l水28.5ml作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA沉淀，Na＋可中和DNA注意：复性时间不宜过长溶液III菌液离心13000rpm,1min弃上清瞬时离心彻底弃上清加250μl溶液P1旋涡振荡悬浮沉淀加250μl溶液P2加400μl溶液P3颠倒数次放置3-5min离心13000rpm,10min取上700μl加到吸附柱中离心13000rpm,1min弃滤液，加入500μl去蛋白液13000rpm,1min离心（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）弃滤液，加入500μl漂洗液WB（10）离心13000rpm,1min
6、弃滤液，加入500μl漂洗液WB（11）离心13000rpm,1min弃滤液（12）空柱离心13000rpm,2min放入一个干净的离心管中(开盖放置3min)，在吸附膜的中间加60μl洗脱液EB(放置1min)离心13000rpm,1min（13）-20℃保存备用操作步骤颠倒数次紫外光吸收法原理：1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2,而且物质对光的吸收是具有选择性的3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系.定量检测计算方法:因为组成核酸的碱基
7、(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。dsDNA(双链DNA)1A260=50ug/mlssDNA(单链DNA)1A260=33ug/mlRNA1A260=40ug/ml定量检测记录A260值，通过计算确定DNA浓度，公式如下:质粒DNA(g/ml)=50×(A260)×稀释倍数注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度和Ratio值.定量检测根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的纯度（Ratio=A260/A
8、280）Ratio=1.8DNA样品较纯,符合实验要求Ratio＞
