实验3质粒dna的提取与鉴定

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1、质粒DNA的提取、定量酶切与鉴定http://jpkc.fimmu.com/sfzx/南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心ExpertimentalTeachingCenterofBiochemistryandMolecularBiology尹莉E-mail:qsdyl_2006@163.com实验内容提取原理操作步骤计算方法操作步骤质粒DNA定量酶切原理酶切步骤酶切电泳原理电泳步骤电泳实验目的掌握碱裂解法提取质粒的方法了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作第一部分质粒DNA提取与定量Extractiona

2、ndQuantitationofPlasmidDNA独立于细菌染色体外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多．质粒（Ｐlasmid）定义碱裂解法煮沸裂解羟基磷灰石柱层析法质粒DNA释放法酸酚法等方法选择哪一种方法主要取决以下几个因素：质粒的大小大肠杆菌菌株裂解后用于纯化的技术和实验要求分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA分离质粒DNA三步曲分离质粒收集裂解细菌质粒扩增基本步骤基本原理1、碱裂解法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差

3、异；高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉定去除；☆原理示意图2、离心层析柱基本原理硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质；通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5α（三）试剂：LB培养基（液

4、体、固体）Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）溶液P1溶液P2溶液P3去蛋白液PE漂洗液WB洗脱液EB仪器材料50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块溶液I0.2mol/LNaOH1%SDS作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。注意：时间勿太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次溶液II5mol/L乙酸钠60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS＋线性DNA

5、沉淀，Na＋可中和DNA注意：复性时间不宜过长溶液III菌液离心12000rpm,1min弃上清短时离心彻底弃上清加250μl溶液P1旋涡振荡悬浮沉淀加250μl溶液P2加400μl溶液P3颠倒颠倒数次放置3-5min离心13000rpm,10min取上清700μl加到吸附柱中离心13000rpm,1min弃滤液，加入500μl去蛋白液13000rpm,1min离心（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）弃滤液，加入500μl漂洗液WB（10）离心13000rpm,1min弃滤液，加入500μl漂洗液WB（11）离心13000rpm,1m

6、in弃滤液（12）离心13000rpm,2min放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加70μl洗脱液EB离心13000rpm,1min（13）-20℃保存备用操作步骤第二部分酶切鉴定DNARestrictionEnzymeDigestion试剂名称体积(µl)无菌水9.010×M酶切缓冲液2.0质粒DNA7.0(约500ng)HindIII(15U/ul)1.0EcoRI(12U/ul)1.0总体积20.0在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次加入下述试剂移液枪轻轻混匀(避免产生气泡),37℃水浴1.5h反应体系限制性内切酶（restriction

7、endonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具。特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制性内切酶限制酶的切割点因酶而异，有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段,如HaeIII,有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ.限制性内切酶★平末端在识别顺序的中心对称轴处切割5’G-G-C-C3’3’C-C-G-G5’5’G-G3’C-C-C-C3’-G-G

8、5’HaeIII限制性内切酶★3’端粘性末端在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’