实验一质粒DNA的提取和鉴定

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1、质粒DNA的提取和纯化郑敏生化与分子生物学系分子生物学从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。基因工程移液器和EP管质粒质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸物质。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。能稳定

2、地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。分类：单拷贝质粒；多拷贝质粒；紧密控制型；松弛控制型；质粒DNA的提取方法碱裂解法；煮沸裂解法；酚氯仿抽提法；概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理。基本思路培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)电泳检测；碱裂解法的基本原理十二烷基磺酸钠(SDS)可使细胞膜裂解。经SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞

3、碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。实验步骤1、将含有质粒DNA的细菌在LB培养基中培养过夜。取1.5mlLB培养液倒入1.5mleppendorf

4、管中，4℃下12000g离心30秒。2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡）。4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴2分钟。5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中5分钟，4℃下12000g离心10分钟。6、上清液（450uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积的饱和酚（1:1），充分颠倒混匀，4℃下12000g离心10分钟。7、将水相（400uL）移入干净eppendorf管中，加入等

5、体积酚/氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心10min。8、将水相（350uL）移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。9、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入0.5ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。10、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。11、将沉淀溶于10μlTE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。LB液体培养基（Luria-Bertani）

6、称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱溶液I：重悬细菌；葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；Tris－HCl：缓冲体系；EDTA：螯合金属离子；溶液Ⅱ0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），

7、1％SDS溶液II——破膜，变性基因组DNA和蛋白质；SDS——破膜作用，变性蛋白质；NaOH——破膜，变性基因组DNA；溶液Ⅲ5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。溶液III——中和溶液，复性质粒DNA；酚/氯仿（1:1）酚——变性蛋白质；氯仿——萃取溶液中的酚；分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。吸取时不要震荡。乙醇无水乙醇（2倍体积）——沉淀质粒DNA；70%乙醇——洗涤质粒DNA沉淀，除去沉淀中的盐分；核酸的定量260nm，1

8、OD值相当于：双链DNA浓度为50g/ml单链DNA浓度为40g/mlA260/A280=1.8（DNA