实验一 质粒dna的提取

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1、实验一质粒DNA的提取一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，

2、接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。反复数次，收集全部菌体。3.倾去上清，滤纸吸干。4.加30μlTE缓冲液（10mmol/LTris—HCl,1mmol/LEDTA,pH8.0）,振荡起菌体。5.加30μlTENS溶液（10mmol/LTris—HCl,pH8.0，1mmol/LEDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。6.加150μl3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离

3、心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。13．37℃水浴30min。14．样品放一20℃冰箱保存备用。三、试剂1．TE缓冲液(10mmol/LTris—HCl,1mmol/LEDTA,pH8.

4、0)配制方法：Tris1.211gEDTA.Na0.037g用800ml重蒸水溶解，用分析纯盐酸调整pH至8.0，加重蒸水定容至1000ml。2．TENS溶液：(10mmol/LTris—HCl,pH8.0，1mmol/LEDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS)配制方法：NaOHO.4gSDS0.5g加80mlTE缓冲液溶解。加TE缓冲液定容至lOOml.3．3.0mol／1醋酸钠溶液(pH5.2)配制方法：醋酸钠24.6g用70ml重蒸水溶解，再用冰乙酸大约调pH至5.2,加重蒸水定容至100ml。纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红色或黄色结晶体，使用之前必须重蒸，

5、除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解，重新进行蒸馏，当温度升至183℃时，开始收集在若干个棕色瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取一瓶重蒸酚于分液漏斗中，加入等体积的lmol／LTris-HCI(pH8.0)缓冲液，立即加盖，激烈振荡，并加入固体Tris摇匀调pH(一般100ml苯酚约加l克固体Tris)分层后测上层水相pH至7.6一8.0。从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中，并加一定体积0.1mol／LTris-HCI(pH8．o)覆盖在酚相上，置4℃冰箱贮存备用。酚是一种强腐蚀剂，能引起腐蚀性损伤，操作时应戴上眼镜和手套。如果皮肤上溅上了酚，应

6、用大量水冲洗或用肥皂水冲洗。酚在空气极易氧化变红，要随时加盖，也可加入抗氧化剂o．1％8一羟基喹啉及o．2％β—巯基乙醇。5．无水乙醇置-20℃冰箱中保存备用 6．70％乙醇置-20℃冰箱中保存备用7．核糖核酸酶(10mg／ml)配制方法：称取l0mg核糖核酸酶A(RNaseA，美国SIGMA或中科院上海生物化学研究所东风试剂厂)。于灭菌的微离心管内，加1ml100mmol／pH5.0的NaAC溶液(完全溶解)，即为10mg／mlRNase，为了破坏脱氧核糖核酸酶(DNase，置80℃水浴中10min或100℃水浴2min，然后置一20℃(或家用冰箱的冰格内)保存。四、材料1．菌种：大肠

7、杆菌(pUC57)2．培养基LB液体培养基精解蛋白胨3g酵母浸出粉1.5g氯化钠3g葡萄糖0.6g按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300ml。用10mol／LnaOH调pH至7．2～7．4。分装于15ml试管中，每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1．1kg／cm2灭菌20min.l抗菌素：氨苄青霉素(Amp)临用时用无菌水配制在无菌有盖试管中，浓度为100mg／m1。五、仪器：恒温振荡器。低温冰箱-20℃真