实验1质粒DNA的提取

《实验1质粒DNA的提取》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、质粒DNA的提取和鉴定实验一一、目的与要求1.掌握碱裂解法提取质粒的方法及原理2.了解用分光光度计测定DNA含量的方法3.了解“过柱”快提质粒DNA二、相关知识及原理质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。质　粒（plasmid）是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、

2、限制酶、修饰酶等质粒的复制：严紧型复制（1～n个）松弛型复制（20个以上）细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。DNA超螺旋结构常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18,pUC19InsertEcoRIXhoI1.9kb严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制

3、寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。质粒类型：质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。载体具备的条件：合适的容量在受体细胞中可以独立复制；易于鉴定；易于筛选；易于制备；易于导入受体细胞。启始复制子（ori,Originofreplication)；多克隆位点(MSC,Multiplec

4、loningsiteorpolylinker)；标记基因(Markergene,suchasLacZgene)。抗性基因（Antibioticresistancegene,suchasAmpicillinresistancegene,Kanamycineresistancegene)载体的结构：三、实验原理碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性

5、蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。碱裂解法基本原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来DNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解

6、，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。实验原理：实验过程1.利用变性后状态不同：在pH12.0～12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。2.利用溶解度的不同：将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。3.利用离心力的不同：通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，

7、质粒DNA尚在上清中，4.利用酚变性结果不同：然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。细菌裂解的方法：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。提纯的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小

8、分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质