质粒DNA的提取纯化与鉴定

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1、质粒DNA的提取、纯化与鉴定南通大学江苏省神经再生重点实验室蒋茂荣一、基因克隆的质粒载体1、定义双链闭环DNA；1kb--200kb；独立存在于宿主染色体之外；具复制起始点；复制和转录不同程度依赖于宿主基因；编码某些酶，使宿主具有特殊标志，可供选择。2、载体性质（1）.复制能力；（2）.容纳外源DNA的能力；（3）.选择标记：抗生素耐受。（4）.引入多克隆位点；（5）.引入重组选择标记。3、载体分类：按功能分1.克隆载体2.表达载体按宿主性质1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬菌粒、λ噬菌体、噬菌体M13等2.真核载体:逆转录病毒、腺病毒、昆虫杆状病毒3.穿梭载体4、

2、常用质粒载体例如：1.pBR322、pUC18/19、pUC118/119、pGEM、pBluescript、pBluescriptSK/KS等2.pET、pGEMEX、pGEX等3.pALTER等5、常用质粒宿主：HB101、DH5α、TG1、JM系列等BL21（DE3）等二、质粒DNA的分离纯化（一）、细菌培养物的生长和收获（二）、质粒DNA的提取1、碱裂解法小量制备质粒DNA:a、细菌的收集；b、加入100цl溶液Ⅰ，重悬细菌；c、加入200цl溶液Ⅱ，使细菌悬液清亮；d、加入150цl溶液Ⅲ，冰上放置3-5分钟；e、加入450цl酚：氯仿混匀；f、1200

3、0rpm，离心5分钟；g、吸取上清，加入2倍体积无水乙醇，室温静置2分钟；h、12000rpm离心5分钟，弃上清；i、75%乙醇洗涤，室温晾干；j、溶于适量TE/R中。三、质粒DNA的鉴定（一）、紫外光谱分析通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯度。（二）、EB荧光分析（三）、电泳鉴定在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA经单一酶切后与DNAMarker进行电泳对照，即可知该质粒的分子量大小。质粒的电泳图谱