质粒dna提取与纯化

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1、....页眉质粒DNA的提取与纯化实验目的：1掌握碱变性法提取质粒DNA的原理和各种试剂的作用及方法。2学习并掌握凝胶电泳法进行DNA的分离纯化的实验原理及方法。3学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。实验原理：简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为

2、经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶序列测定及分析。碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。....页脚.....页眉在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在PH高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA烦人氢键断裂双螺旋结构解开而变性，共价闭环状质粒DNA的大部分氢键断

3、裂而变性，但两条互补链不完全分开。当用PH为4.6的KAc高盐溶液调节PH至中性时，变性的质粒DNA可发生复性恢复共价闭环的超螺旋结构而溶于溶液中，而染色体DNA不能复性，与不稳定大分子缠连在一起形成沉淀，通过离心与溶于溶液中的质粒DNA分离。溶于上清液中的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液使之凝聚成沉淀。由于RNA与DNA性质相似，乙醇沉淀DNA时也伴随着RNA的沉淀，可用RNA酶降解。质粒DNA溶液中的RNase以及一些可溶蛋白可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动速度可因

4、电离子的大小，形态，电荷量的不同而有所差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因此可用凝胶电泳法分离，鉴定和纯化DNA片段。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭（EB）染色直接观察到，甚至含量少至20Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。....页脚.....页眉琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶

5、电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：（1）样品DNA分子的大小（2）缓冲液,（3）温度（4）DNA分子的构象：一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。（5）琼脂糖浓度：通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。（6）电泳所用电场：凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V／cm。实验准备实验仪器与

6、材料：恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml离心管，50ml离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，梳子，锥形瓶，离心机。菌体：E.coliDH5a受体菌，具有Ampr标记的质粒DNApUC19.实验试剂及其理化作用：LB培养液，抗生素溶液Ⅰ（50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0）：葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA....页脚.....页眉是阳离子螯合剂，抑制DNase的活性。溶液Ⅱ（0.2MNaOH/1%SDS）：使细胞破裂，使质粒

7、DNA与染色体DNA同时变性。溶液Ⅲ（3M醋酸钾/2M醋酸）：这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀。加醋酸中和使溶液呈中性，使变性的质粒DNA复性，但不能使染色体DNA复性。RNase酶母液，TE缓冲液（10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)），饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：氯仿可使蛋

8、白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。遇冷无水乙醇，70%乙醇，TAE电泳