质粒DNA提取纯化与验证

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1、......【实验目的】1、掌握碱变性提取质粒DNA法的原理、过程及各种试剂的作用。2、掌握凝胶电泳对DNA分离纯化的原理和方法。【实验原理】1、提取、纯化质粒DNA（碱变性提取法）提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细

2、菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，

3、而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。2、琼脂糖凝胶电泳电泳（electrophoresis)是带电学习好帮手......物质在电场中向着与其电荷相反的电极

4、方向移动的现象。各种生物大分子在一定条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(EB)或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至

5、20Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：1)样品D

6、NA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与相对分子质量(所含碱基)的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。2)DNA分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)的一条链断裂，变成开环DNA(opencircleDNA，oeDNA)分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA(1inerDNA，LDNA)分

7、子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。3)琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。4)电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度DNA泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为

8、了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V／cm。学习好帮手......5)缓冲液：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。当电泳液为去离子水(如不慎误用去离子水配制凝胶)，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下(如错用10×电泳缓冲液)，导电性极高，带电颗粒泳动很