质粒DNA的提取与鉴定.doc

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1、质粒DNA的提取与鉴定目的学习和掌握用碱变性法从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法，以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。原理质粒(plasmid）是一种独立的稳定的遗传因子，存在于细菌等细胞中。它们为双链、闭环的DNA分子,大小从1kb到200kb不等，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的DNA基因信息，但其复制和转录要利用宿主细胞编码的一些酶和蛋白质，而宿主在没有质粒时是可以正常生长的.因此，质粒是一种寄生性的自主复制子.细菌质粒是基因工程中常用的基因载体，也是分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达的好材料。从大肠杆

2、菌分离质粒的方法很多，碱变性抽提法是常用的方法之一，此法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的条件下,染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性;质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离,当用pH4.8的Kac高盐缓冲液调节pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。在抽提过程中,由于各种因素的影响，质粒DNA可能以三种形式存在:共价闭环DNA（cccDNA),常以

3、超螺旋形式存在；开环DNA（ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条链发生一处或多处断裂，形成缺刻，可以自由旋转从而消除了张力,形成松弛的环状分子;线状DNA(LDNA），质粒DNA的两条链在同一处断裂所形成。在电泳时,同一质粒DNA的泳动速度根据迁移率从小到达分别为开环,线形和超螺旋DNA。cccDNA含量越高，表明制备的质粒DNA质量越好.操作步骤1.取1.5ml细菌培养液于2mlEppendorf离心管中，4℃，5000rpm，离心5min，弃上清（将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体尽可能流尽),保留菌体沉淀。2。沉淀悬浮于100ul预冷的试剂Ⅰ（TEG

4、缓冲液）中，混匀（置混合器振荡），冰上置10min.3.加入新配制的试剂Ⅱ（碱裂解液）200ul，加盖，轻轻颠倒3～4次,冰上置10min。4。加入预冷的试剂Ⅲ（乙酸钾溶液）150ul，盖紧管盖，颠倒数次，冰上置10min。12000rpm,4℃，离心10min，以除去细胞碎片及大部分细菌染色体DNA。5.上清液移入另一干净离心管中，加入等体积的平衡酚轻摇,12000rpm，4℃，离心10min。6。取上层水相置于另一离心管中，加入等体积的氯仿（氯仿：异戊醇=24:1）抽提，12000rpm,4℃，离心10min。7.取上层水相置于另一离心管中，加入2倍体积的预

5、冷的无水乙醇，混匀后，置-20℃过夜(至少要放置2h以上)。8.12000rpm，4℃,离心10min,弃上清,将管口倒置于纸巾上使所有液体尽可能流出。9。加入1ml70%乙醇洗沉淀一次。12000rpm，4℃,离心10min。10。弃上清，将管口倒置于纸巾上使液体流尽，放置干燥或真空干燥，即得质粒DNA制品。10。将沉淀溶于20ulTE缓冲液，(临用前加入1u或20ug/mlRNaseA)待用。DNA的琼脂糖凝胶电泳原理DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液)带负电荷,外加电场作用下,向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的

6、泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带.溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在波长254nm紫外光照射下插入溴化乙锭的DNA显橙红色荧光,在波长300nm紫外光照射下DNA显橙黄色荧光。所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置.核酸构型不同,在凝胶中的电泳速度差别较大.同一质粒DNA的泳动速度次序为：共价闭环DNA＞线状DNA＞开环DNA操作1.琼脂糖凝胶的制备：本实验采用1。0%的琼脂糖凝胶.称取0.3g琼脂糖放入锥形瓶，加入30ml电泳缓冲液,置于微波炉使其充分融化。室温放置至60℃左右，加入EB使其终浓度为0.5ug/ml,混匀，倒胶板(30ml

7、/板)。1.凝胶板的制作：用1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两端边缘围成高4mm的墙,在其一端放置样品梳。将准备好的模板置于水平台上,迅速将上面胶液倒在模板的中央，让胶液自由流向四周。待胶液充分冷却凝固，将胶纸围墙慢慢取下，制备好的凝胶板放入电泳槽中，加电泳缓冲液直至没过胶面约1mm深，取出样品梳。3.加样：4.电泳：盖好电泳槽盖，接好电源，样品端接负极，5V/cm，电泳至指示剂距离凝胶前沿约1cm处时停止电泳。5.检测：三实验报告要求1。原理2.操作3.结果（铅笔绘图：正负极，条带数目、强弱、距离，)4。结果说明四思考题1。碱法分离质粒DNA原理?2。为什么从

8、细胞中分离DNA时往往会