青蒿琥酯诱导hl60细胞凋亡的研究

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1、青蒿琥酯诱导HL60细胞凋亡的研究作者：刘俊玲，虞荣喜，陈均法【摘要】　　本研究旨在研究青蒿琥酯体外诱导HL60细胞凋亡及其过程中Bcl2与ICAD蛋白表达的变化。采用MTT法测定青蒿琥酯对HL60细胞的生长抑制作用；用光学显微镜检、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术观察和检测青蒿琥酯诱导HL60细胞的凋亡；应用蛋白印迹法检测青蒿琥酯诱导HL60细胞凋亡过程中Bcl2与ICAD的表达变化情况。结果表明：青蒿琥酯对HL60细胞有明显的生长抑制作用，并呈时间、剂量依赖性。48小时IC50值为18.33μg/ml，其增殖抑制作用与诱导细胞凋亡

2、有关；Bcl2和ICAD在HL60细胞中均有表达，且随药物浓度的增高表达量逐渐降低。结论：青蒿琥酯可诱导HL60细胞凋亡，Bcl2和ICAD在青蒿琥酯诱导HL60细胞凋亡的信号传导途径中可能是重要的调控因子。【关键词】青蒿琥酯　HL60细胞系　细胞凋亡　　ApoptosisofHL60CellsInducedbyArtesunateInVitroAbstractThestudyedtoinvestigatetheeffectofartesunate(ART)ontheapoptosisofHL60cellsinvitroandt

3、heexpressionofBcl2andICADintheprocessofapoptosisinducedbyART.TheinhibitionofARTonHL60cellseansofMTTassay;cellapoptosisicroscopy,agarosegelelectrophoresis,floetry;I1640配制所需浓度；碘化丙啶（PI）、噻唑蓝（MTT）为Sigma公司产品；细胞凋亡DNALadder提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司；bcl2和ICAD单克隆抗体均为美国SantaCruz公司产品。

4、细胞系及细胞培养急性早幼粒细胞白血病细胞株HL60由浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所提供。细胞按常规悬浮细胞培养法培养于含10%热灭活小牛血清的RPMI1640培养液中，置37℃、5%CO2培养箱中培养。每2-3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。MTT测定取对数生长期细胞，调整细胞浓度至1×105/ml，接种于96孔板，每孔100μl，青蒿琥酯终浓度分别为1、2、4、8、16、32、64及128μg/ml，每孔100μl，设空白对照组。药物分别作用24、48、72小时后，每孔加MTT20μl，于37℃、5%CO2培养箱中培养4小时，离

5、心弃去上清液，每孔加入DMSO150μl，振荡摇匀，在570nm酶标仪上测吸光度值（A570），计算抑制率，求半数抑制浓度IC50。细胞抑制率（%）=（A对照－A实验/A对照）×100%细胞经对照组、给药组作用48小时后，收集细胞，经磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）洗2遍后，细胞制片机离心、制片，ulticycle2.50DNA分析软件处理。Bcl2和ICAD表达的mol/LHEPES，pH7.0,250mmol/LNacl,0.1%NP40,5mmol/LEDTA）,蛋白酶抑制剂与细胞裂解液之比为1∶9，置于冰上裂解20分钟，稍振荡，4

6、℃10000rpm离心15分钟，收集上清。用5×SDS上样缓冲液变性蛋白，煮沸后以10μg蛋白／泳道等量上样，12%SDSPAGE经80V电泳分离至分离胶后，120V电泳分离不同分子量蛋白，以湿式转膜法在4℃，250mA，2小时将其转移至PVDF膜。取出膜并将与胶接触面朝上置于5%的脱脂奶粉（pH7.4的TBST配制）室温下轻轻摇动封闭2小时。分别加入一抗，分别是鼠抗人Bcl2浓度为1∶200，鼠抗人ICAD浓度为1∶100，兔多抗Betaactin浓度1∶1000为一抗（5%的脱脂奶粉，pH7.4的TBST配制）及1∶5000稀释的辣根

7、过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、羊抗兔Betaactin二抗（5%的脱脂奶粉，pH7.4的TBST配制），显色，在暗室内曝光摄片。以βactin作为内参照。统计学分析数据用均数±标准差（±SD）表示，三组间数据比较用单因素方差分析q检验，检验以P<0.05或P<0.01为差异显著的标准。采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。所有实验结果均重复3次。结果青蒿琥酯对于HL60细胞的增殖抑制作用不同浓度青蒿琥酯作用于HL60细胞24、48、72小时后的抑制率与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.01）（表1），青蒿

8、琥酯对HL60细胞的增殖抑制作用呈明显的时间剂量依赖性，24、48、72小时的IC50分别为52.61、18.33、0.81μg/ml。HL60细